新孢子虫分泌蛋白的种类及其功能

吴凯剑 ， 刘 群

(中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

犬新孢子虫(Neosporacaninum，简称新孢子虫)由Dubey等于1988年鉴定并命名[1]，是多种动物共患原虫，终末宿主是犬科动物，中间宿主是包括犬在内的多种温血动物，主要寄生于中枢神经系统、肌肉组织和视网膜等器官组织的有核细胞中。新孢子虫病已是公认的致牛流产的主要原因之一。新孢子虫隶属于顶复合器亚门、真球虫目、肉孢子虫科、新孢子虫属，如图1所示，其具有该类原虫的三大重要的分泌细胞器，即微线体、棒状体和致密颗粒，是虫体分泌蛋白的主要来源，虫体的表面蛋白和其他分泌排泄产物也是重要的分泌蛋白。已知分泌蛋白在虫体黏附、入侵、增殖以及逸出等生命活动中具有重要作用，其中有些蛋白是影响新孢子虫毒力的重要因子，或是重要的诊断抗原和免疫原。目前已有新孢子虫的多种分泌蛋白得到鉴定，对它们的功能也有一定的认识，本文对新孢子虫主要分泌蛋白的研究报道进行总结和分析，以期为新孢子虫的深入研究提供参考资料。

图1 新孢子虫分泌蛋白在入侵时的功能A:新孢子虫的超微结构示意图; B:新孢子虫入侵宿主时蛋白分泌示意图(①:新孢子虫以低亲和力接触到宿主细胞膜；②:微线体分泌微线体蛋白，介导虫体以更强的亲和力黏附在细胞表面；③:棒状体分泌棒状体颈部蛋白和棒状体蛋白；④、⑤：棒状体颈部蛋白与微线体蛋白形成滑动连接，推动虫体进入宿主细胞；⑥：新孢子虫进入宿主细胞后进行二分裂，逐渐形成纳虫空泡，虫体分泌致密颗粒蛋白和棒状体蛋白修饰纳虫空泡。部分致密颗粒蛋白和棒状体蛋白能够定位于宿主细胞核，向宿主细胞核传递信号，调控宿主细胞周期)

1 微线体蛋白(Microneme protein，MICs)

在顶复亚门不同属、种和同一虫种的不同发育阶段中，微线体的数量差异很大，通常代谢旺盛或滑动活跃的虫种或发育阶段虫体含有较多的微线体，而运动较少或不活跃的、非入侵宿主阶段的原虫则含有较少或者没有微线体。新孢子虫速殖子含有丰富的微线体蛋白，在运动、黏附和入侵过程中起重要作用。

新孢子虫的分泌蛋白中，关于微线体蛋白的研究报道最多。目前，已经鉴定出新孢子虫NcMIC1、NcMIC2、NcMIC3、NcMIC4、NcMIC6、NcMIC8、NcMIC10、NcMIC26、类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶1(Subtilisin-like serine protease 1，NcSUB1)、顶膜抗原1(Apical membrane antigen 1，NcAMA1)和NcMIC2的同系物NcMIC2-like等多种微线体蛋白。

1.1 成熟分泌 微线体蛋白有一些共同结构特征，其一是具有前体和成熟体2种形式。除了NcAMA1，大多数微线体蛋白都为I型跨膜蛋白，含有C端跨膜结构域和N端信号肽。微线体蛋白前体的跨膜结构域会在微线体中或在分泌前被切割成成熟体，然后在信号肽引导下定位到正确位置，切割新孢子虫微线体蛋白的酶尚不清楚。成熟的微线体蛋白在虫体入侵细胞前定位在微线体中，入侵过程或入侵后大量地集中在速殖子后端。

微线体蛋白的分泌受到虫体内钙离子的调控，虫体黏附细胞后，体内钙离子浓度升高刺激微线体蛋白分泌。NcMIC3比较特殊，其分泌不受钙离子调控，并且不严格地定位在微线体上。在胞外或进行入侵时，NcMIC3以温度依赖性形式弥散分布在虫体表面，随后向虫体后端转运，完成入侵后定位于微线体[2]。

1.2 黏附结构域 微线体蛋白的另一个重要特征是大多数都具有1个或多个黏附结构域，属于黏附蛋白，能与宿主细胞直接结合，便于入侵。目前已经鉴定出多种新孢子虫微线体蛋白的黏附结构域，大多数与其他真核生物的黏附结构域有较高的同源性。包括整合素样结构域(I或A结构域)和5个血小板反应蛋白重复序列(Thrombospondin domains，TSP)、唾液酸结合黏附重复结构域(Microneme adhesive repeat，MAR)、表皮生长因子样结构域(EGF-like domain，EGF)和Apple域[2-3]。在其他的原虫中，还发现了包括小隐孢子虫的黏蛋白样结构域、疟原虫的Duffy样结合结构域 (Duffy binding-like domain，DBL)和泰勒虫的富含半胱氨酸的结构域[2,4-5]。

微线体蛋白的黏附结构域与宿主表面受体(糖蛋白或糖脂复合物)结合，使虫体黏附在细胞表面，这是新孢子虫入侵宿主细胞的基础。微线体蛋白识别的受体包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素以及人工硫酸化的糖胺聚糖-葡聚糖硫酸盐等。已有研究证实，NcMIC1、3、4在体外能够与宿主细胞表面的多硫酸化糖胺聚糖(NcMIC1、3)或硫酸软骨素(NcMIC4)结合[2,6-7]，干扰硫酸化蛋白多糖的合成或抑制其硫酸化过程。寄生虫的黏附结构域是潜在的药物靶点，结合生物信息学分析黏附结构域的晶体结构，解析其与宿主细胞互作的虫体特异性结合位点，对结合位点进行突变或者利用虚拟筛选寻找针对结合位点的小分子抑制剂，有助于研发有效的弱毒活疫苗或者药物。已有疟原虫DBL结构域的特异性结合位点为DBL3X-DBL4ε[4]，但是在新孢子虫中相关的研究还很少。

微线体蛋白和宿主细胞的结合与膜肌动蛋白-肌球蛋白运动蛋白互相有关，对虫体运动至关重要。NcMIC2的TRAP样蛋白结构域(Thrombospondin-related anonymous protein，TLP)是顶复亚门原虫滑动体的组件蛋白，参与虫体运动[4]。NcMIC6通过参与虫体的滑移运动从而促进虫体从细胞中逸出[8]。

1.3 微线体蛋白复合物 微线体蛋白在运输和分泌过程中均以复合物形式发挥作用。在弓形虫中已经报道了4种互作的微线体蛋白复合物：TgMIC1/4/6、TgMIC2/M2AP(MIC2相关蛋白)、TgMIC3/8和TgAMA1/RON2/4/5/8(棒状体颈部蛋白2/4/5/8)，并且证明了AMA1/RON2/4/5/8复合物与运动连接(Moving junction，MJ)结合，对入侵至关重要[9]。在新孢子虫中，通过免疫共沉淀已经鉴定出NcMIC1/4/6和NcMIC3/NcMIC8两对复合物[8,10]。与弓形虫不同的是，新孢子虫NcMIC6不影响NcMIC1和NcMIC4的定位，说明了新孢子虫和弓形虫入侵的机制存在差异[8]。

关于新孢子虫微线体蛋白如何参与虫体入侵过程及微线体蛋白复合体的功能仍有待深入研究。

2 棒状体蛋白(Rhoptry protein，ROPs)

棒状体位于新孢子虫前端，其数量与生活史阶段有关。棒状体又分为颈部和球部，分别分泌棒状体颈部蛋白(Rhoptry neck protein，RONs)和棒状体蛋白(Rhoptry protein，ROPs)。新孢子虫中关于RONs的研究很少。

2.1 定位与功能 棒状体蛋白是顶复亚门原虫特有的蛋白家族，在寄生虫侵入细胞前后分泌，其功能与定位相关。有些棒状体蛋白定位于纳虫空泡膜(Parasitophorous vacuole membrane，PVM)，在入侵时与宿主蛋白互作，或在胞内与致密颗粒蛋白一起修饰和维持纳虫空泡膜和纳虫空泡网络(Parasitophorous vacuole network，PVN)；有些定位于宿主细胞核，通过纳虫空泡(Parasitophorous vacuole,PV)向宿主细胞核传递信号调节寄生虫的毒力；另一些定位在宿主细胞质，发挥重塑宿主的肌动蛋白细胞骨架的功能。棒状体蛋白为新孢子虫重要的毒力因子，也是抵御宿主防御系统的关键。

2.2 ROP2蛋白家族 根据棒状体蛋白的功能，分为不同蛋白家族。最大的棒状体蛋白家族为ROP2家族，也被称为棒状体激酶家族(Rhoptry kinases，ROPKs)，分为激酶和假激酶。新孢子虫ROPs中，已报道的NcROP2Fam-1、NcROP2、NcROP5、NcROP16、NcROP18和NcROP40都属于ROP2家族。虽然弓形虫和新孢子虫的许多ROPKs具有同源性，但是两者编码毒力因子的结构域有显著的差别，ROPKs的表达水平也不同。不同虫株、寄生虫不同生活史阶段的ROPKs表达水平也存在显著差异。这是导致寄生虫毒力差异的关键。

ROP2家族的共同特征是在信号肽切割位点后含有富含精氨酸(R-rich)的结构域，另外还有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域(NTE)。前者是由3个R-rich结构域组成，其核心是1个疏水性α螺旋，影响ROP2家族蛋白与纳虫空泡膜的结合[11]。后者决定了ROPKs的激酶磷酸化活性。但是并非所有ROPKs都含关键的催化残基，而许多假激酶已经进化出替代磷酸化的方式[12]。真核生物的蛋白激酶起到介导信号转导的作用，所以棒状体激酶家族是非常重要的毒力家族，也是很有前途的免疫抗原，发掘更多的ROPKs及研究其功能对研究新孢子虫病的致病机理至关重要。

目前已经报道了几种重要的ROP2家族毒力因子，最先被表达克隆的是NcROP2，定位于PVM，通过与宿主互作参与寄生虫入侵过程[11]，另一个ROPs家族蛋白NcROP2Fam-1也影响虫体的入侵过程，但是由于NcROP2Fam-1缺乏必要的激酶催化残基，所以尚未清楚其是否有激酶活性。

TgROP18是第1个被报道的弓形虫毒力因子，与TgROP17和假激酶TgROP5形成复合物，受到TgGRA7的调控，使免疫相关的GTPase家族(IGRs)磷酸化，发挥免疫逃避作用[12]。NcROP18却是1个假基因[13]，ROP18基因的不同是造成弓形虫和新孢子虫毒力差异的关键因素。

NcROP5是新孢子虫的毒力因子之一[14]，能抑制IGRs的鸟苷酸结合蛋白GBP1和GBP2向纳虫空泡聚集，抵御宿主对新孢子虫的泛素化和降解纳虫空泡。缺失NcROP5会影响NcROP17和NcGRA7的转录水平。

NcROP16也是重要的毒力因子之一[15]，定位于宿主细胞核和细胞浆，由磷酸激酶介导在宿主细胞中磷酸化信号转导和转录激活因子3(STAT3)，诱导宿主的凋亡。

3 致密颗粒蛋白(Dense granule protein，GRAs)

目前，已经报道的致密颗粒蛋白有NcGRA1、NcGRA2、NcGRA3、NcGRA4、NcGRA6、NcGRA7、NcGRA9、NcGRA11、NcGRA12、NcGRA14、NcGRA17、NcGRA23、核苷水解酶(NcNTPase)和基质抗原1(Matrix antigen 1，NcMAG1)等。

3.1 分泌与定位 大多数致密颗粒蛋白都包含1个N端信号肽和跨膜结构域，并且具有翻译后修饰。致密颗粒蛋白分泌前定位于致密颗粒，在PVM形成初期以类似于胞吐的方式从寄生虫顶端、侧面和后部分泌，其分泌机制尚不清楚。已知致密颗粒蛋白的分泌不受钙离子调控，却受温度影响[16]，原因未知。

致密颗粒蛋白分泌后有3种定位形式：定位于纳虫空泡膜、定位于纳虫空泡腔和定位于纳虫空泡中的网管状纤维网络。

3.2 功能及机制 致密颗粒蛋白主要功能是修饰PVM，维持纳虫空泡的形态稳定，促进速殖子在纳虫空泡中的营养摄取和物质交换，维持新孢子虫在宿主细胞中的正常生长和复制。Yang等[17]证明了NcGRA17的α螺旋是维持纳虫空泡的形态的必要条件。董井泉[18]发现，NcGRA2、NcGRA4、NcGRA6和NcGRA9能形成一种与PVN结构相关的复合体，其核心是NcGRA2，但是对该复合体的功能没有做进一步研究。有些致密颗粒蛋白可能存在内质网滞留信号，参与PV与宿主ER细胞器的招募/结合；有些能介导PV与宿主细胞线粒体的结合；还有些能够进入宿主细胞核，调控宿主细胞周期。

NcGRA7是第1个被报道的致密颗粒蛋白，被研究得最多。早期对NcGRA7的研究主要集中在定位、血清学诊断和免疫活性分析上。抗NcGRA7抗体具有特异性，与弓形虫缺乏交叉反应，是很强的诊断标志物[19]。NcGRA7参与宿主的细胞和体液免疫，是重要的疫苗候选蛋白。

近年来对NcGRA7的研究多集中在致病机制上。一方面，NcGRA7通过调节宿主免疫反应调控新孢子虫病的发病机制。NcGRA7与NcGRA6、NcGRA14参与调控NF-κB、钙调神经磷酸酶和cAMP-PKA信号通路的激活[20]，影响宿主细胞因子和趋化因子的产生，如IFN-γ、IL-1β、IGPs和IRGs[19]，能够抑制宿主IRGa6向PVM募集，从而逃避宿主免疫反应。NcGRA7还能调控多种与宿主细胞周期、泛素化、RAS信号相关的蛋白的表达。另一方面，NcGRA7影响新孢子虫自身的复制，调节多种新孢子虫基因的表达，包括代谢、转运蛋白和抗原、泛素化、剪切和翻译后修饰相关的基因[19]。因此，NcGRA7是新孢子虫毒力的关键因子。NcGRA7与新孢子虫中其他分子或宿主因子的互作、对基因调控的影响尚未见报道。

NcGRA6是第2个被报道的致密颗粒蛋白，具有抗原特异性，可用作新孢子虫病的血清学诊断抗原。它同时以可溶性和跨膜形式存在，定位于PV和IVN。Zhao等[21]发现敲除NcGRA6会显著抑制新孢子虫的早期增殖，证明了NcGRA6是新孢子虫感染早期的重要毒力因子，但是对NcGRA6的毒力机制没有进一步研究。

NTPase具有NDPK(核苷二磷酸水解酶)活性，为I型核苷三磷酸水解酶(NTPDase)，属于致密颗粒蛋白。该酶在速殖子阶段大量分泌到PV，由PV中的二硫醇化合物或二硫醇氧化还原酶激活，能够影响ATP的合成和虫体分化，维持虫体的营养获取和介导GRA蛋白定位到PV和PVN[22]，维持PV的形态。NcNTPase缺乏NDPK活性，并且在强毒株中表达量更高。NcNTPaes和NcGRA7在入侵和逸出早期会上调并磷酸化[16]，说明二者可能在参与虫体分裂周期中起到协同调控作用。

4 其他分泌蛋白

除了上述三大分泌蛋白，近年来报道的菱形蛋白酶(Rhomboids，ROM)也是重要的分泌蛋白，菱形蛋白酶作为一种丝氨酸蛋白酶，对虫体入侵起关键作用，是重要的疫苗靶点。

目前在包括泰勒虫、巴贝斯虫、疟原虫和弓形虫等多种顶复亚门原虫中都有菱形蛋白酶的报道[23]，弓形虫菱形蛋白酶能够识别和切割黏附素，使虫体不再黏附于宿主表面，从而进入宿主细胞中。菱形蛋白酶还在线粒体融合、生长因子信号传导中发挥重要作用[24]。目前尚未有关于新孢子虫菱形蛋白的报道，但是ROM基因的氨基酸序列在顶复门原虫中保守，其功能可能也相似。

5 展望

新孢子虫病对养牛业危害严重，是近年来备受重视的寄生虫病，至今没有有效的药物和疫苗用于该病的防控。分泌蛋白在新孢子虫的生命活动中发挥重要作用，有些重要蛋白可能是研制新孢子虫的药物和疫苗的重要靶点。目前关于许多新孢子虫分泌蛋白的研究较为浅显，对其功能、机制及其在新孢子虫病防控中的作用均需深入研究。当前，新的生物学技术不断开发和应用，为新孢子虫病的深入研究提供了更好的机会，新孢子虫分泌蛋白的鉴定、功能及其作用机制的深入研究，能够为全面解析其致病机制和防控技术的研发提供科学依据。