临床病料采集、保存、送检及安全防护方法

周绪正 蔺红玲 李 冰 牛建荣 魏小娟 李金善李剑勇 杨亚军 刘希望 张继瑜*

1.国家肉牛牦牛产业技术体系疾病控制功能研究室，兰州 730050；

2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 730050

在动物检疫及监督的日常工作中，常会遇到一些用感官难以确诊或定性的染疫动物或产品，对于这些动物或产品，需要通过实验室检查才能作出诊断。而一些兽医基层单位，因技术人员知识结构的差异，往往不知道应该如何正确操作，也不懂如何自我保护。本文从病料采集前的准备、采集注意事项、常见动物病料的采集方法、病料的固定和保存、病料的送检以及工作人员的安全防护6个方面进行系统阐述，供各试验站基地、基层单位在实际工作中参考，为实现科学、健康、安全养殖保驾护航。

1 病料采集前的准备

首先应做好采样计划，如要采集足够量的病料，还要准备采集后用具等清洗、消毒用的消毒液及容器等用品。采集病料所用的刀、剪、镊子等用具需煮沸30min；使用前用酒精擦拭、火焰消毒；装载的器皿经121℃高压30min或160℃干烤2h；准备一次性针头和注射器或真空采血管；采集一种病料，使用一套器械与容器，配制一定量的固定液和保存液。

2 采集注意事项

2.1 细菌性病料的采集

当怀疑动物或其产品为细菌感染时，为确定病菌种类，合理地采集细菌含量最多的病料是做好检验定性的第一步。对于活的病畜禽，应注意采集其血液、口鼻分泌物、乳汁、脓汁或局部肿胀渗出液、体腔液、尿液、生殖道分泌物和粪便等。对死亡动物采集病料时，应剥去皮肤，打开胸腹腔，以无菌操作采集病料。采集病料的种类应根据生前发病情况或所作的初步诊断有选择地采集含菌量相应最多的脏器或内容物。

2.2 病毒性病料的采集

当初步诊断为病毒感染时，若需从动物活体上采集病料，必须在发病初期、急性期或发热期采集；否则，病毒会很快在血液中消失，组织内病毒的含量也会因抗体的产生而迅速下降。若从死亡动物尸体上采集病料，其方法与细菌性疫病病料的采集方法基本相同。但无论是从活体还是死尸上采集病料，都既要避免污染，又要防止病毒被灭活。

2.3 死因不明动物病料的采集

对无法作出初步诊断的死因不明动物采集病料应尽量全面系统，或根据症状和病理变化有所侧重。有败血症病理变化时，应采集血、淋巴结、心、脾、肝等；有明显神经症状者，应采集脑、脊髓；有黄疸、贫血症状者，可采集肝、脾等。

2.4 采集过程中的注意事项

采样所用刀、剪要锐利，切割要迅速准确，且忌拉锯式切割，并要防止挤压病料而造成人为变化；采集的组织标本应包含病变和其周围较正常的组织，包含器官的重要组成部分，如肾应有皮质、髓质、肾盂等，肝、脾、肺应含有包膜；病料的大小应适宜，以利于及时而彻底地固定；死后要立即采集病料，夏季不能超过4h，若拖延过久，则组织可能发生变性、腐败，影响检验结果。当怀疑为炭疽时应禁止剖检，可在颈静脉处切开皮肤，抽取血液作血片数张，立即送检；排除炭疽后，方可剖检取材。除病理组织学检验病料及胃肠内容物外，其他病料应无菌采集；器械及容器应事先灭菌；当采集活体病料时，如有多数动物发病，取材时应选择症状和病变典型的病例，最好选择未经抗菌素治疗的病例。

3 常见动物病料的采集方法

3.1 血液的采集

1）部位。牛、羊常在颈静脉采血，猪在耳静脉（较大的猪）或前腔静脉（较小的猪）采血，禽从翅静脉采血，兔从耳静脉或颈静脉采血。

2）操作。采血时，先将采血部位清洗干净，用75%的酒精消毒，待干燥后采血。对牛、羊、猪和兔采血，一般用一次性采血器或注射器，吸出后放试管内；或直接用针头（一般用三棱针）穿刺静脉后，将血液滴到直径为3～4mm（可用人用的一次性输液管）塑料管内（长度一般为5cm），将口封好，竖立存放；也可用一次性真空采血管采血。

3）保存。如需要全血样品，在采血前应直接向采血管中加入抗凝剂，如EDTA、肝素等，最好加入肝素作为抗凝剂，采血后充分摇匀；如需用血清样品，则不需加抗凝剂，在室温下（不能暴晒）静置，待血清析出，经离心机离心分离出血清，分装。全血和血清若要长时间保存，则可置冰箱冷冻层（保存时间视冰箱的温度），但不可反复冻融；如短时间保存，可以冷藏。

3.2 组织的采集

实质性组织，如肝脏、肺脏、脾脏、心脏、肾脏、淋巴结等，一般最好采集整个脏器。但是考虑到病料的固定和检验的目的性，用于微生物学检验的内脏组织块不必太大，有1～2cm见方即可（如有少量污染或不能保证无污染，组织块取大些，切割后用），将采集好的样品置于已经消毒的容器内；若用于病理组织学检查，则要采集病灶及临近正常组织，并存放于10%福尔马林溶液中固定（如作冷冻切片用，应将组织块置于冷藏容器中，并尽快送实验室检验）。采集动物的内脏组织时，如是已死亡的动物应尽快采集，夏天不应超过2h，冬天不超过6h（还要视具体温度而定）；采集的动物病料必须新鲜，尽可能减少污染。

3.3 尿液的采集

在动物排尿时，用一次性消毒塑料杯接取。

3.4 阴道分泌物的采集

1）棉拭子法。将消毒棉拭子插入动物阴道内，然后在阴道内轻轻转动几下后取出，即可进行涂片镜检。对体型较大的动物，也可先按摩或刺激其阴部，而后再采集其阴道液。

2）刮取法。用光滑的玻璃小勺或牛角制的小刮片慢慢插入阴道内，在阴道壁轻轻刮取一点阴道分泌物，进行涂片镜检。

3.5 呼吸道分泌物的采集

用灭菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉内的分泌物，蘸取后立即放入特定的保存液中（如灭菌肉汤、磷酸相加缓冲液、Hanks液等），每个棉拭子需保存液5mL。

3.6 皮肤的采集

用锋利的外科刀刮取病变部皮肤结痂、皮屑及毛或刮取病变与健康部位交界处的皮肤组织放容器中送检。

3.7 唾液的采集

1）直接抽取法。动物口腔或唾液腺导管抽吸唾液，此法非常简单，但从口腔抽吸唾液会有杂质混入。

2）制造腮腺瘘法。要用外科手术方法将腮腺导管开口移向体外，即以腮腺导管为中心，切成一直径2～3cm的圆形黏膜片，将此黏膜片与周围组织分开，穿过皮肤切口引到颊外，将带有导管开口的黏膜片与周围的皮肤缝合，腮腺分泌的唾液就流出颊外，这种方法可以收集到较纯净的唾液。

3.8 胃液的采集

一般采用直接收集胃液法，先将动物麻醉，将胃管经口插入胃内，在胃管的出口连吸耳球或注射器，抽吸使胃管内形成负压，胃液靠大气压顺胃管流出，此法适用于牛、狗等大型动物；或者用pH7.5、35℃左右的生理盐水灌胃，来回抽插胃管，收集流出液，进行分析。

3.9 肠内容物的采集

选病变明显的肠道，用吸管扎穿从中吸取内容物，放入30%甘油盐水缓冲液保存送检；或将一段有内容物的肠管两端扎紧，剪下送检；另外，还可先烧灼肠浆膜，然后自该处穿破肠壁，用吸管或棉花球采取内容物检查，或装在消毒的广口瓶中送检。怀疑为中毒的动物，可采集残余饲料、呕吐物、胃内容物、粪便和血液等。

3.10 胰液和胆汁的采集

通过对胰总管和胆总管的插管而获得胰液或胆汁；或者通过外科手术的方法在紧靠肠壁处切开胰管，结扎固定并与导管相连，即可见无色的胰液流入导管，采集1～2mL即可。

3.11 流产胎儿的采集

将整个胎儿放塑料袋中送检。

3.12 脑组织的采集

开颅后取出大脑和小脑，纵切成两半，一半放入50%甘油生理盐水瓶中供微生物检验用，另一半放入10%的戊二醛溶液内供组织学检查和电镜检查用。

3.13 乳汁的采集

乳房和乳房附近的毛以及术者的手，均需用消毒液洗净消毒；将最初的几股乳汁弃去，然后采取乳汁10～20mL于灭菌容器中。

3.14 寄生虫病料的采集

1）蠕虫的采集。蠕虫卵：用漂浮法或沉淀法从粪便中收集或将活虫置生理盐水中，让其产卵后收集，放入加热到75～80℃的巴氏液（40%甲醛溶液30mL，氯化钠75g，水1000mL）中保存；也可用含有40%甲醛溶液10mL、95%乙醇30mL、甘油40mL、蒸馏水56mL的混合液保存。大型蠕虫（如蛔虫）：用弯头针、毛笔将虫体收集在生理盐水中，洗除虫体上的粪便、黏液，然后保存于70%乙醇或4%甲醛中（固定液加热到70℃左右，再投入虫体，使虫体在热固定液中伸直而固定）。绦虫：如头节还吸附于肠壁上，为了保证虫体的完整，切勿用力猛拉，而应将附着有虫体的肠段剪下，连同虫体浸入生理盐水中5～6h后，头节会自行脱落，体节也自行伸直。细小蠕虫（如线虫）：用分离针等小心从胃肠内容物中挑出，放入盛有生理盐水的小试管内，塞紧，充分振荡，将污物洗净，然后放入煮沸的5%甘油酒精中，使虫体伸展保存。

2）蜘蛛、昆虫的采集。可从动物体表或外界环境中采集。保存蜘蛛类（蜱、螨等）可将其投入开水中片刻，然后保存于70%乙醇内（最好加入5%的甘油）。细小昆虫（如螨和虱蠓等）个体较小，常需刮取皮屑，可直接用70%酒精保存。

3）原虫的采集。血液内原虫可制成血片用甲醇固定，各片间用硬纸片隔开，用线扎紧；也可采用抗凝血迅速送检。组织内原虫一般在死后剖检时，取一小块组织，做成抹片或组织切片送检。粪便内原虫（球虫），一般情况下采集新排出的粪便，按蠕虫虫卵收集方法进行卵囊收集。保存卵囊是保存球虫最常用的方法，在收集到的卵囊中加入2.5%重铬酸钾，置室温中待其孢子形成，孢子形成后的卵囊可在5～20℃的常温下保存1a。

4 病料的固定和保存

实质性器官的病料存放在消毒过的容器内。若用于病理组织学检查，存放于10%福尔马林溶液或10%的戊二醛溶液中（如作冷冻切片用，应将组织块放在冷藏容器中，并尽快送实验室检验）；短时间内不能送到的病料，上面加灭菌石蜡油2～3cm，用蜡封固，置于装有冰块的冰瓶中迅速送检（没有冰块时，可在冰瓶中加冷水，并加入等量硫酸铵，可使水温冷至零下，将装病料的小瓶浸入此液中送检）；夏天在运输时间长时，要勤换固定液。亦可将病料浸入保存液中，供微生物学检查的液体病料，需包扎牢靠，以防止外溢污染、变质；供血清学检查的血清装入灭菌小瓶内。细菌性病料可用饱和盐水或30%甘油缓冲液，病毒性病料可浸于50%甘油缓冲液中。进行微生物学检验的病料，若病料不能立即送检，最佳的保存方法应为冷冻或冷藏。

5 病料的送检

要求送检人员应对动物的整个发病情况十分了解或有详实的记录，最好是现场技术人员亲自送检，以便提供畜群发病过程的全部信息，对实验室诊断十分重要。禁止送检死亡过久或腐败变质的病料，这种病料对诊断毫无意义，而且还拖延了诊断时间，对疾病的及时有效控制极为不利。微生物检验用病料，尽可能专人送检；送检时，除注意冷藏保存外，还需将病料妥为包装，避免破损散毒。用冰瓶送检时，装病料的瓶子不宜过大，并在其外包一层棉花，途中要避免振动、冲撞，以免碰破冰瓶。若系邮寄送检，应将病料于固定液中固定24～48h后取出，用浸有同种固定液的脱脂棉包好，装在塑料袋中，放在木盒内邮寄；邮寄标本同时，应附上尸体剖检记录等有关材料一份，填写送检动物组织种类、数量、检验目的、病料所用固定液种类、送检时间、送检单位和送检人及通信地址。每种病料都要附以标鉴，并复写送检单一式3份，1份存查，2份寄往检验单位，检验完毕后退回1份。

6 工作人员的安全防护

人畜共患病严重影响人类（特别是与畜禽密切接触者）的健康及生命安全。世界上已发现的人畜共患病有200多种，经常流行、危害严重的有30多种，如疯牛病、炭疽、猪链球菌病、结核病、猪囊尾蚴病、牛囊尾蚴病、旋毛虫病、弓形虫病、钩端螺旋体病、沙门菌病、血吸虫病、狂犬病、高致病性禽流感、鼠疫等。兽医工作人员尤其是病料采集人员由于频繁接触患病动物，所以是人畜共患病的高危人群，因此，应警惕人畜共患病对自身的感染。鉴于上述原因，工作人员在采集病料时应该注意以下几点：第一，注意饮食卫生，禁止食用死亡的动物。第二，如果条件允许，可以接种疫苗。接种疫苗的主要目的是降低感染普通传染病的几率。第三，工作人员在采集病料时更应注意个人卫生，工作时戴口罩、穿工作服（防护服）、戴手套，接触患畜或其粪便等污染物后要勤洗手，并保持工作环境中空气流通。第四，工作人员应该对动物粪便作及时处理，注意圈舍的消毒。

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