黑曲霉DPUM-J2和毕赤酵母DPUY-J8在大酱发酵中的应用

2022-09-28郭琳洁顾金红李思怡牟光庆妥彦峰

食品研究与开发 2022年18期

郭琳洁，顾金红，李思怡，牟光庆，妥彦峰

（大连工业大学食品学院，辽宁大连 116034）

大酱是以大豆为原料，利用环境中的微生物自然发酵而成的半流动状态的发酵食品，在中国具有悠久的历史，因其具有很高的营养成分以及独特的风味口感而深受人们的喜爱。大豆中蛋白质含量在38%以上，同时大豆中还存在异黄酮、维生素和矿物质等成分[1]。大酱的传统发酵方法，从制曲到发酵成熟，是多种微生物共同作用的结果，其中酵母菌和霉菌是主要的优势菌。酵母菌在大酱发酵过程中对大酱风味的形成有很大的影响，还对大酱颜色的稳定和原料利用率的提高起着重要作用。霉菌是大酱发酵过程中制备酱曲的主要微生物，对后期的发酵至关重要[2]。霉菌产生的淀粉酶、蛋白酶将原料中的碳水化合物和蛋白质分解为糖类、肽以及氨基酸，带给大酱独特的风味，同时为后期发酵过程中其他微生物的生长代谢也创造了有利条件[3]。在一些传统发酵获得的大酱中可检测到生物胺和黄曲霉毒素，这是由一些不具有安全性的微生物产生的[4]。为了保障食品安全，应筛选具有优良发酵性能和安全性的霉菌及酵母菌用于大酱生产，从而提高大酱的安全性，改善大酱品质。

本研究以豆粕、面粉、食盐等为生产原料并且利用从大酱中分离的菌种（黑曲霉DPUM-J2和毕赤酵母DPUY-J8）以及大酱商业化生产菌株酱油曲霉，进行大酱实验室规模发酵实验。对比不同发酵菌株的生产性能和安全性，不同发酵菌种在控制大酱生物胺、黄曲霉毒素方面以及理化指标和挥发性化合物的性能，为生产企业提供优质发酵剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑曲霉DPUM-J2和毕赤酵母DPUY-J8：从东北传统农家大酱样品中分离出来，保藏于大连工业大学益生菌功能特性研究重点实验室；大酱商业化生产菌株酱油曲霉：大连棒槌岛调味品厂；丹磺酰氯、乙腈（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；3，5-二硝基水杨酸、甲醛、环己酮：上海生工试剂公司；组氨酸等氨基酸前体物质（分析纯）、哥伦比亚培养基：北京索莱宝科技有限公司；蛋白酶活性检测试剂盒、淀粉酶活性检测试剂盒：上海钰博生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

WP-250微生物培养箱：上海精密实验设备有限公司；DK-S22电热恒温水浴锅：上海精宏仪器公司；SX-500自动高压灭菌锅：日本Tomy公司；T5自动电位滴定仪：梅特勒-托利多公司；7809B/5975C气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株和培养条件

霉菌在28℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）中培养 48 h，酵母菌在 28℃的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose，YPD）中培养48 h。PDA培养基成分：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、琼脂（20 g）、水（1 000 mL）。YPD 培养基成分：酵母浸粉（10 g）、蛋白胨（20 g）、葡萄糖（20 g）、琼脂（20 g）、水（1 000 mL）。

1.3.2 菌株的安全性评价

1.3.2.1 菌株产生物胺含量的测定

在PDA液体培养基和YPD液体培养基中分别加入0.1%的前体氨基酸和0.005%的磷酸吡哆醛，121℃灭菌20 min，将活化好的霉菌孢子悬液和酵母菌分别接种到上述PDA和YPD液体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养48 h。采用丹磺酰氯进行衍生[5]。

色谱条件：色谱柱为华普C18柱（250 mm×4.6 mm×5.0 μm）；流动相为水和乙腈；柱温为40℃；流速为1.0 mL/min；进样量为30 μL；紫外检测波长为235 nm。

1.3.2.2 菌株溶血性测定

在超净台中向灭菌后的哥伦比亚培养基加入5%的绵羊血，晃匀后进行倒板划线，置于28℃培养箱中培养48 h，观察菌株周围是否有透明圈[6]。出现草绿色环是α溶血性；出现透明的溶血环是β溶血，未出现变化则是不溶血。

1.3.2.3 菌株对抗生素敏感性测定

采用药敏纸片法对菌株耐药性进行检测。参照Shi等[7]的方法，来确定菌株对所选抗生素的敏感性。选取益康唑、伊曲康唑、克霉唑、酮康唑、咪康唑、两性霉素、氟康唑7种抗生素进行酵母菌药敏试验。配制YPD培养基，灭菌后将待测菌株倾注在平板上，倒平板后在平板上贴上药敏片，使抗生素扩散0.5 h，然后在28℃培养48 h。抑菌圈直径用于区分菌株对抗生素敏感程度。

1.3.3 菌株的生产性能评价

发酵培养基：称取5.00 g黄豆于锥形瓶中，加入50 mL 2.5 mol/L的NaCl溶液，121℃灭菌20 min。

粗酶液的制备：将待测菌株按2%接种于发酵培养基中，酵母菌28℃培养48 h；发酵培养48 h后离心（10 000 r/min，20 min），收集上清液即为待测粗酶液。

1.3.3.1 菌株α-淀粉酶活力测定[8]

依据淀粉酶试剂盒对酵母菌和霉菌的α-淀粉酶活力进行测定。

1.3.3.2 菌株蛋白酶活力测定

将处理好的粗酶液依据总蛋白酶试剂盒对酵母菌和霉菌的蛋白酶活力进行测定。

1.3.4 大酱的制备

大酱制作的工艺流程图如图1所示。

图1 大酱工艺流程Fig.1 Manufacture procedure of soybean paste samples

将脱脂大豆应以70℃～80℃左右的热水浸润40min后，开始蒸料，原料蒸好后再混入面粉，在121℃灭菌20 min。出锅后冷却到45℃以下，接入0.5%种曲，混合均匀。制曲过程温度为35℃，培养48 h，中间进行2～3次的翻曲。制曲结束后用18°Be′盐水拌入成曲内，盐水量为原料质量的160%，置于40℃发酵30 d。分组情况为酱油霉菌制曲，并进行发酵生产（酱油曲霉）；酱油霉菌制曲，加入毕赤酵母进行发酵生产（酱油曲霉+毕赤酵母DPUY-J8）；黑霉菌制曲，并进行发酵生产（黑曲霉DPUM-J2）；黑霉菌制曲，加入酱油酵母进行发酵生产（黑曲霉DPUM-J2+毕赤酵母DPUY-J8）。

在大酱发酵过程中，取发酵时间分别为0、5、10、15、20、25、30 d 来进行检测分析。

1.3.5 大酱发酵过程中生物胺的测定

根据GB 5009.208—2016《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》第一法，对大酱中生物胺含量进行检测。

1.3.6 大酱发酵过程中黄曲霉毒素B1含量的测定

根据GB 5009.22—2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》第三法，对大酱中黄曲霉毒素B1含量进行检测。

1.3.7 大酱发酵过程中pH值的测定

称取5 g大酱，加入10 mL去离子水，用pH计测定大酱中pH值。

1.3.8 大酱发酵过程中总酸的测定

根据GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》进行测定。将大酱样品在研钵中研磨均匀无颗粒，称取5.00 g放入烧杯，加40 mL水，搅拌均匀，转移入50mL容量瓶，用少量水冲洗，合并于容量瓶，定容。取10mL，加入30mL去离子水，用NaOH（0.1 mol/L）将pH值滴定至8.2，记录所消耗的NaOH体积，同时需要以40 mL去离子水作为空白重复上述步骤。

1.3.9 大酱发酵过程中还原糖的测定

采用3，5-二硝基水杨酸法，具体操作如下。

1.3.9.1 样品中还原糖的提取

称取5 g研磨好的大酱，加入40 mL去离子水，混匀，于80℃恒温水浴锅中保温30 min，使还原糖浸出，滤纸过滤，将滤液收集在50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原提取液。

1.3.9.2 样品中还原糖的测定

在试管中加入1 mL还原糖提取液、1 mL蒸馏水和1.5 mL二硝基水杨酸，混匀后在沸水浴中加热5 min，冷却至室温，在每管中加入21.5 mL蒸馏水，摇匀后在540 nm处检测吸光度值。

1.3.10 大酱发酵过程中氨基酸态氮的测定

参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中酸度计法。向1.3.8方法制备的样品中加入10 mL甲醛溶液，用氢氧化钠溶液滴定到溶液pH值为9.2，同时用40 mL去离子水作为空白组，重复上述步骤。

1.3.11 大酱中挥发性化合物的测定

挥发性风味物质采用顶空固相微萃取技术进行提取[9]。通过气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）测定大酱样品中的挥发性风味化合物[10]。以10 μL环己酮（10 μg/mL溶于乙醇）作为内标物置于20 mL固相微萃取顶空瓶中。称取2 g研磨好的大酱样品置于顶空瓶中，65℃水浴中30 min，然后插入老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头萃取30 min。

色谱条件：氦气作为载气，流速为1.0mL/min。升温程序：35℃保持3min，3℃/min升温至50℃，再以6℃/min升温至150℃，然后以10℃/min升温至230℃，最后在230℃下保持6 min。质谱条件：采集质量范围m/z 40～350，离子源温度为230℃，电子电离模式为70 eV。

挥发性组分采用NIST数据库比对进行定量分析，根据内标物的浓度和峰面积的比值确定样品中每种成分的峰面积与内标物的峰面积之比来计算被测组分的相对含量。

1.4 数据处理与分析

选用SPSS19.0进行单因素分析，选用Origin 8.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 菌株产生物胺能力

生物胺是大酱发酵过程中微生物脱羧产生的低分子氮化合物，摄入高浓度的生物胺可能会导致严重的健康问题[11]，因此对黑曲霉DPUM-J2和毕赤酵母DPUYJ8产生物胺情况进行检测。菌株产生物胺量见表1。

表1 菌株产生物胺量Table 1 Biogenic amine content of yeast

从表1中可以看出，两株菌均不产生物胺，是安全的，可用于大酱的发酵。

2.2 菌株溶血性检测结果

溶血菌株能够破坏氧色素蛋白被释放到细胞周围而致病。因此，溶血性是评价菌株安全性的重要指标[12]。对毕赤酵母DPUY-J8的溶血性进行检测，结果如图2所示。

图2 菌株溶血性检测结果Fig.2 Hemolysis test results of strains

由图2可看出，A为单增李斯特菌株，作为本试验的阳性对照菌株，可以明显的看出菌株周围有透明光圈，具有β溶血性。而毕赤酵母DPUY-J8周围没有出现透明或草绿色的光圈，说明不具有溶血性，是安全的。

2.3 抗生素敏感性检测结果

抗生素耐药性与菌株的安全性有关。耐药菌株可以将耐药基因转移到病原体中，因此用于食品发酵的菌株应该对抗生素具有敏感性[13]。对毕赤酵母DPUYJ8的抗生素敏感性进行了检测，如表2所示。

表2 毕赤酵母DPUY-J8对抗生素的敏感性Table 2 Sensitivity of Pichia kudriavzevii DPUY-J8 to antibiotics

由表2可知，毕赤酵母DPUY-J8对常规的抗生素基本都表现出敏感性，安全性较高，可以作为安全菌株应用于大酱发酵中。

2.4 菌株酶活力

在大酱发酵过程中，微生物产生的蛋白酶可以将原料大豆中的蛋白质分解成较小的分子，如肽和游离氨基酸，分泌的淀粉酶可将原料中的淀粉糖化，这对大酱的风味和颜色发展起着至关重要的作用[14]。因此，具有高蛋白酶和淀粉酶活性的菌株是提高大酱质量的关键。对黑曲霉DPUM-J2和毕赤酵母DPUY-J8的蛋白酶和淀粉酶活性进行了检测，结果如表3所示。

表3 菌株蛋白酶和淀粉酶活力Table 3 Protease and amylase activity of strain

由表3可知，两株菌显示出较高的酶活力，可用于大酱的发酵。

2.5 大酱发酵过程中生物胺含量

大酱发酵过程中生物胺含量变化见表4。

表4 大酱发酵过程中生物胺含量变化Table 4 The change of biogenic amine content in soynean paste mg/kg

生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、亚精胺、组胺、精胺、章鱼胺和酪胺等，是大酱发酵过程中氨基酸和氮化合物经过微生物脱羧作用产生的低分子含氮化合物[15]。在大酱发酵过程中，测定不同发酵阶段各组大酱中生物胺的浓度。从表4中可以看出，生物胺含量随着发酵的进行而逐渐增加，直到发酵结束。生物胺的积累主要是由于微生物作用于蛋白质，分解形成较多的氨基酸，氨基酸进一步分解形成生物胺。总生物胺含量在48.20 mg/kg～241.61mg/kg，处于安全水平。腐胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、亚精胺在每个样品中均有检出。添加黑曲霉组大酱样品中生物胺低于酱油曲霉组，可能是因为黑曲霉对生物胺具有一定的降解作用。组胺是8种生物胺中毒性最强的胺[16]，4组大酱中的组胺含量随着发酵时间的延长，含量逐渐累积。接种酵母菌的大酱中组胺含量低于未接种组，这可能是由于酵母菌对某一些产生组胺的微生物有一定程度的抑制作用[17]，从而减少了组胺的积累。

不同微生物发酵对大酱中生物胺的降低率见表5。

表5 不同微生物发酵对大酱中生物胺的降低率Table 5 Degradation rate of biogenic amine in soybean paste by different microbial fermentation%

以酱油曲霉组作为对照，对不同样品组大酱对生物胺的降低率进行计算。对比商业发酵剂酱油曲霉发酵大酱，添加实验室分离获得的黑曲霉发酵大酱总生物胺降低52.07%，对苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺分别降低42.60%、49.07%、52.42%和98.77%，实验室分离获得的黑曲霉和酵母菌发酵的大酱，尸胺和组胺含量分别降低57.27%和92.52%，添加酱油曲霉和实验室分离的酵母菌发酵大酱的总生物胺的含量降低13.08%，腐胺、尸胺、组胺的含量分别降低35.65%、43.17%和98.26%。

2.6 大酱发酵过程中黄曲霉毒素B1含量

大酱发酵过程中黄曲霉毒素B1含量变化见表6。

表6 大酱发酵过程中黄曲霉毒素B1含量变化Table 6 The change of aflatoxin B1content in soynean paste

通过表6数据可以发现所有大酱样品中都没有检测到黄曲霉毒素B1，所以本试验发酵的大酱中黄曲霉毒素处于安全水平。

2.7 大酱发酵过程中pH值的变化

大酱发酵过程中的pH值变化如图3所示。

图3 不同发酵阶段大酱的pH值变化Fig.3 The changes of pH value of soybean paste at different fermentation stages

大酱的pH值在4.1～6.5。在制曲结束后，即发酵第0天时，添加黑曲霉组远低于酱油曲霉组，证明在大酱的制曲过程中，黑曲霉在大酱曲中生长旺盛，将大豆原料中的脂肪分解产生脂肪酸等酸类物质[18]，从而导致pH值的降低。pH值较低有利于抑制有一些有害菌的生长，从而减少大酱中的危害物质[19]。在大酱的整个发酵过程中，添加酵母菌组的大酱pH值均低于空白组，主要是由于添加酵母菌的大酱组中的菌株大量繁殖，将大酱中的碳水化合物分解成有机酸[20]，从而降低了大酱的pH值。在大酱发酵的前5 d，pH值急剧下降，随后趋于稳定。在发酵后期，大酱中的醇类物质也会与酸结合形成中性的酯类，因此在大酱发酵后期pH值的变化趋于稳定。

2.8 大酱发酵过程中总酸的变化

总酸包括蛋白质发生化学反应产生的酸以及霉菌酵母菌代谢产生的酸，如脂肪酸、有机酸等，在大酱发酵过程中，总酸对大酱的品质有着重要影响，总酸含量的多少决定了大酱的口感，与发酵过程中微生物群落的生长与交替有一定的影响，总酸同时也是是生成风味物质如酯类物质的原料。不同发酵时间大酱中总酸含量的变化如图4所示。

图4 不同发酵阶段大酱的总酸变化Fig.4 The changes of total acid of soybean paste at different fermentation stages

总酸的变化与pH值的变化相对应。在发酵过程中，总酸不断累积，总酸的含量逐渐增加，到第30天发酵结束时总酸的含量最高，整个发酵过程中总酸的含量在（0.49±0.01）g/100 g～（1.51±0.05）g/100 g，低于国家标准GB/T 20560—2006中规定的酱类食品的总酸含量（2.0 g/100 g）。4组大酱样品在发酵过程中变化趋势相似，在0～5 d总酸含量迅速增加而后趋于稳定，在25 d～30 d也呈现增加趋势。黑曲霉处理组的总酸含量高于酱油曲霉组的总酸含量，这是由于接种黑曲霉在大酱中大量繁殖代谢产生酸性物质，从而导致总酸含量增加。

2.9 大酱发酵过程中还原糖的变化

还原糖的含量与大酱风味物质有着密切联系，对于大酱颜色和风味的形成具有关键性影响，是反映大酱质量的重要参数[21]。大酱在发酵过程中还原糖的变化如图5所示。

图5 不同发酵阶段大酱的还原糖含量变化Fig.5 The content of reducing sugar of soybean paste at different fermentation stages

还原糖含量范围在（0.95±0.01）g/100 g～（10.24±0.29）g/100 g之间。在大酱的发酵过程中还原糖含量变化分为两类：一类是呈现上升趋势，一类是呈现下降趋势。在发酵前期，黑曲霉大量生长繁殖代谢产生的淀粉酶和糖化酶将大豆原料中的淀粉水解产生还原糖，酱曲中的还原糖大量溶出使还原糖含量增加。酱油曲霉+酵母组还原糖含量下降一方面可能是由于还原糖作为碳源，酵母菌的生长繁殖会有所消耗，另一方面，还原糖和氨基反应，产生美拉德反应导致还原糖含量会有所下降[22]。在大酱发酵结束后，添加黑曲霉组的还原糖含量明显高于添加酱油曲霉组，还原糖含量高可以赋予大酱甜味的口感，缓解有机酸带来的酸味，改善大酱的口味。

2.10 大酱发酵过程中氨基酸态氮的变化

大酱中的氨基酸态氮的含量变化如图6所示。

图6 不同发酵阶段大酱的氨基酸态氮含量的变化Fig.6 The content of amino nitrogen of soybean paste at different fermentation stages

由图6可知，氨基酸态氮的含量在（0.41±0.01）g/100 g～（1.26±0.09）g/100 g，符合国家标准不得小于0.5 g/100 g的要求。随着发酵时间的延长，氨基酸态氮含量不断增加[23]，是因为在发酵过程中蛋白酶将大豆原料中的蛋白质降解为多肽和氨基酸，氨基酸的积累使得大酱中氨基酸态氮含量随着时间增加而增加[1]。在整个发酵过程中，接种黑曲霉组样品中的氨基酸态氮含量均低于接种酱油曲霉的氨基酸态氮含量，这可能是由于微生物大量生长繁殖消耗了部分氨基态氮，另一方面由于一些风味物质和色素的形成也会消耗氨基酸所以使得氨基酸态氮的含量增加缓慢，同理，接种了酵母组的氨基酸态氮也略低于未接种组。

2.11 大酱中挥发性化合物的含量

大酱中挥发性化合物的含量见表7。

表7 大酱中挥发性化合物的含量Table 7 The content of volatile flavor compounds in soybean paste μg/g

采用固相微萃取结合气-质联用提取分析不同组大酱样品中的挥发性香气成分[24]。共鉴定出47种挥发性成分，包括醇类8种、醛类11种、酯类13种、酮类3种、酸类4种、酚类3种、吡嗪类1种、其他类4种。其中，黑曲霉+酵母组的挥发性化合物种类最多，占到了63.83%。何天鹏等[25]发现在大酱中加入酵母菌在挥发性香气物质种类和含量上远优于不加酵母的对照组。

从鉴定出的结果来看，酯类化合物的种类最多。乙酸乙酯具有特有的相似于菠萝味的果香气；亚油酸乙酯、油酸乙酯主要是由大豆中的亚油酸衍生而来，带有油脂的气味[26]。酯类化合物在大酱发酵过程中主要是由微生物的酶或非酶催化的酯化反应而生成的[27]。其次是醛类化合物，醛类化合物对大酱的香气贡献较大，其阈值较低。醛类化合物是在大酱的发酵过程中由碳链氧化或脂肪酸脱羧基形成的[28]。苯甲醛有近似于杏仁的气味；苯乙醛具有类似于甜香和玫瑰花花香；壬醛具有瓜果香和青香。这些化合物可以赋予大酱坚瓜果香和青香。糠醛含量的提升有助于大酱本身的防霉作用。苦味氨基酸异亮氨酸作为2-甲基丁醛的前体物质，它的提升对苦味氨基酸的转化提高，对口感有一定的帮助[25]。酮类化合物中的3-辛酮具有薰衣草味的水果香气，在只添加黑曲霉组检测到少量的3-辛酮，对大酱的香气有所贡献[29]。苯醌样微甜味、酒窖、黄油气味，在黑曲霉+酵母组检测到。由微生物生成的蛋白酶催化反应可以形成吡嗪类化合物，在添加黑曲霉组有二甲基吡嗪的检出，二甲基吡嗪具有咖啡、可可的香气，可以增加大酱的烤香味，使大酱的香气更加浓郁[30]。