子宫颈癌患者血清中miR-101的表达及其通过Rac1调控子宫颈癌细胞丝状伪足的形成

木叶斯尔·买买提，聂 磊，徐梦伟，吕单单，王伟旭，吴姝言，林 晨

子宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，浸润和淋巴结转移是其预后不良的主要原因[1]。miRNAs属于短链非编码RNA，调节细胞的分化、增殖、存活、代谢及肿瘤转移等生理病理过程[2]。细胞骨架结构的异常在肿瘤转移中扮演不可或缺的角色[3]。有研究表明，miR-124-5p[4]、miR-551b-5p[5]等通过抑制mRNA翻译或促进其降解来调节基因转录后表达水平[6]，进而使细胞骨架重排[7]，最终引起癌症的转移[8]。本组前期实验发现miR-101在子宫颈癌细胞和组织中表达下调，其促进子宫颈癌细胞的侵袭及迁移，生物信息学预测分析发现Rac1是miR-101的可能靶基因。

本实验通过检测子宫颈癌患者血清中miR-101的表达，分析其与临床病理特征的关系，明确血清中miR-101表达的临床意义，进一步探究miR-101通过调控靶基因Rac1在子宫颈癌细胞丝状伪足形成中的作用机制，为miRNAs在肿瘤治疗及预后评估中的作用提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 临床样本收集2020年4～12月新疆医科大学第三附属医院存档的18例子宫颈癌患者和20例健康体检者血清。所有患者术前均未行放、化疗和靶向治疗等，术后病理确诊为子宫颈鳞状细胞癌。本实验经新疆医科大学伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 子宫颈癌细胞培养及转染用含10%胎牛血清的中糖培养基培养人子宫颈鳞状细胞癌细胞SiHa(武汉普诺赛公司)，置于37 ℃ 5%CO2的培养箱中培养，按常规方法进行传代及冻存。细胞悬浮液接种于6孔板中，待细胞生长至70%融合度时，按质粒转染试剂Lipo8000(上海碧云天公司)及基因片段(美国Proteintech)说明书进行转染。实验分为三组，即NC mimic组、miR-101 mimic组、miR-101 mimic+Rac1组。

1.3 双荧光素酶报告基因实验生物信息学预测分析发现Rac1是miR-101的可能靶基因。构建h-Rac1-WT、h-Rac1-MUT 3′UTR双报告基因载体及has-miR-101-3p mimic和Non-target Control。培养SiHa细胞，分别加入两种靶基因3′UTR双报告基因载体和0.1 μL Lipo8000试剂，用5 μL完全培养基稀释0.225 μL Lipo8000试剂的混合溶剂，再用hsa-miR-101-3p mimic和Non-target Control分别转染SiHa细胞，转染后采用Dual-Luciferase Reporter Assay System检测Firefly Luciferase报告基因的表达水平。

1.4 qRT-PCR按照试剂盒说明书提取RNA，反转录成cDNA，将cDNA样本置于-80 ℃冰箱，以备后续扩增使用。分别以cel-miR39、U6和GAPDH作为内参，引物的设计与合成均由上海生工生物公司完成。采用2-ΔΔCt法分析miR-101、Rac1基因表达情况，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR检测基因的引物序列

1.5 Western blot法细胞生长至90%后，按照试剂盒说明书提取蛋白及定量。煮沸所需蛋白，并通过SDS-PAGE分离。电泳(80 V 30 min，110 V 50 min)，电转(110 V 1 h)后，室温封闭1.5 h。4 ℃孵育一抗过夜(Rac1稀释比1 ∶1 000～1 ∶1 500；GAPDH稀释比1 ∶5 000，美国Abcam公司)。二抗孵育1 h(Rac1稀释比1 ∶5 000；GAPDH稀释比1 ∶8 000，美国Abcam公司)，使用成像系统(美国Bio-Rad公司)检测蛋白质条带灰度值。

1.6 免疫荧光采用玻璃底四孔皿培养细胞，待细胞贴壁，并生长状态良好时，PBS浸泡3次，每次5 min。使用4%多聚甲醛固定20 min。山羊血清封闭30 min，PBS浸泡3次。滴加一抗(Rac1稀释比1 ∶200)，每孔200 μL，4 ℃孵育过夜。PBS浸泡，添加荧光二抗(Alexaflour549稀释比1 ∶500)，室温封闭2 h。PBS浸泡，用DAPI原液对细胞核进行复染，随后PBS浸泡。使用免疫荧光共焦激光扫描显微镜(日本Nikon公司)观察和记录。鬼笔环肽定量F-actin实验中配置好的TRITC Phalloidin罗丹明标记鬼笔环肽工作液在山羊血清封闭后便可添加，后进行核染色。

1.7 扫描电镜细胞接种于30 mm培养皿中，待细胞贴壁后用PBS缓冲液冲洗，加入多聚甲醛固定20 min，PBS缓冲液冲洗，梯度乙醇脱水，干燥，将处理好的样品放于真空镀膜机内，将金喷镀到样品表面后，取出样品在扫描电镜下观察丝状伪足(细胞表面生出无定形的丝状突起)形成情况，选取9个高倍镜视野，手动记数每高倍镜下1个完整细胞的丝状伪足数并取平均数。

2 结果

2.1 子宫颈癌患者血清中miR-101的表达及其与临床病理特征的关系与健康体检者(1.00±0.13)相比，子宫颈癌患者血清中miR-101的表达水平明显降低(0.40±0.05)(P<0.01，图1)，且与子宫颈癌分化程度呈负相关(Z=2.974，P=0.003)，与患者年龄、肿瘤直径、病理分期、淋巴结转移、血管浸润和神经浸润均无关(P>0.05，表2)。

表2 miR-101表达与子宫颈癌临床病理特征的关系[中值(p25，p75)]

图1 子宫颈癌患者和健康体检者血清中miR-101的表达

2.2 子宫颈癌细胞中miR-101的表达NC mimic组与对照组子宫颈癌SiHa细胞相比，miR-101表达差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组(0.93±0.03)和NC mimic组(1.01±0.04)SiHa细胞相比，miR-101 mimic组(7.13±0.22)miR-101表达量明显升高(P<0.01，图2)。

图2 三组子宫颈癌SiHa细胞中miR-101的表达

2.3 miR-101对Rac1的靶向作用验证

2.3.1双荧光素酶报告基因实验 miR-101与Rac1-3′UTR有结合作用，与NC mimic组相比，转染hsa-miR-101-3p后，h-Rac1-MUT的报告荧光表达(0.65±0.05)较h-Rac1-WT的报告荧光表达(0.49±0.05)明显升高(P<0.05，图3)，即Rac1是miR-101的靶基因。

图3 双荧光素酶报告基因实验检测miR-101与Rac1的靶向关系

2.3.2miR-101对Rac1的调控作用 Western blot实验结果显示：miR-101 mimic组子宫颈癌细胞中Rac1蛋白表达量(0.22±0.03)与NC mimic组(1.00±0.17)相比明显降低(P<0.05，图4A、B)。qRT-PCR检测结果显示：与NC mimic组(1.00±0.02)相比，miR-101 mimic组(0.40±0.01)子宫颈癌细胞miR-101表达明显降低(P<0.01，图4C)。免疫荧光法检测显示：子宫颈癌细胞中Rac1蛋白呈红色荧光，且定位于细胞膜，与NC mimic组相比，miR-101 mimic组子宫颈癌细胞Rac1蛋白表达降低(图4D)。

图4 miR-101对Rac1的调控作用：A.上调miR-101表达后Rac1蛋白表达量降低；B.Western blot法检测结果；C.上调miR-101表达后Rac1 mRNA表达量降低；D.上调miR-101表达后Rac1在细胞膜上的表达减弱

2.4 高表达Rac1对miR-101调控的子宫颈癌细胞丝状伪足形成的影响扫描电镜结果显示，子宫颈癌细胞中NC mimic组、miR-101 mimic组、miR-101 mimic+Rac1组的丝状伪足数分别为(70±3)、(39±10)、(57±9)个，与NC mimic组相比，miR-101 mimic组和miR-101 mimic+Rac1组差异均有统计学意义(P<0.01)；与miR-101 mimic组相比，miR-101 mimic+Rac1组子宫颈癌细胞丝状伪足数增多(P<0.01，图5A)。免疫荧光显示，相同激发光强度下，与NC mimic组相比，miR-101 mimic组子宫颈癌细胞F-actin表达含量较低，而miR-101 mimic+Rac1组子宫颈癌细胞F-actin表达含量明显升高(图5B)。

图5 高表达Rac1对miR-101调控的子宫颈癌细胞丝状伪足形成的影响：A.上调Rac1表达可部分逆转miR-101对子宫颈癌细胞丝状伪足形成的抑制；B.上调Rac1的表达可部分逆转miR-101对F-actin蛋白的抑制

3 讨论

大部分子宫颈癌患者可通过筛查获得有效预防[9]。转移是子宫颈癌患者死亡的主要原因，然而目前尚无更好的手段来预防或控制转移[10]。肿瘤细胞的侵袭、迁移与细胞骨架蛋白重排密切相关。有研究表明miRNAs可通过靶向调控细胞骨架相关蛋白的表达，进一步影响下游信号通路蛋白的表达，从而造成癌细胞迁移、侵袭等[11]。有文献报道，miR-92a通过直接靶向PIK3R1促进子宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移[12]。miR-106b-5p通过靶向CNN1和调控Rho/ROCK1通路促进乳腺癌肺转移[13]。因此，深入探索miRNAs调控细胞骨架影响肿瘤转移的分子机制，对于寻找早期子宫颈癌分子靶标从而阻止其转移至关重要。

循环miRNAs在血液中可稳定检测，被认为是癌症筛查的理想生物学标志物，其中miR-101具有肿瘤抑制特性，在结直肠癌[14]、胃癌[15]和肺癌[16]患者血清中表达下调。本实验结果显示，子宫颈癌患者血清中miR-101表达下调，其与子宫颈癌分化程度密切相关，与文献报道结果一致。提示检测血清miR-101含量可以进一步评估子宫颈癌恶性程度，协助判断子宫颈癌患者预后。

miRNA可通过调节靶基因的蛋白表达水平参与肿瘤的发展过程[17]。有研究发现，miR-139通过下调Rho激酶的表达抑制肝癌细胞的侵袭和转移[18]。Wang等[19]报道，在甲状腺癌细胞中高表达miR-101可抑制Rac1蛋白的表达。本实验发现，子宫颈癌细胞中miR-101表达降低，上调miR-101表达后Rac1在转录后水平通过3′UTR内的特定靶点受到miR-101的负调控，且高表达miR-101抑制Rac1 mRNA和蛋白的表达水平。

Rac1是小GTPase的一份子，参与多种动态细胞生物学过程，包括细胞增殖、侵袭、细胞间接触等，是肌动蛋白细胞骨架重塑的调控复合体[20]。细胞骨架在维持细胞形态有序性方面起重要作用，主要包括微管、微丝和中间纤维，由F-actin构成的微丝能控制细胞迁移能力[21]。Rac1及其下游效应物的激活与乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌和食管癌等肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移有关。有研究发现NPs介导的miR-34a上调后Rac1表达降低，随后肌动蛋白解聚，破坏肌动蛋白细胞骨架，导致细胞表面的板状伪足和丝状伪足形成显著减少，延缓细胞迁移[22]。本组扫描电镜结果显示，miR-101过表达后子宫颈癌细胞丝状伪足数明显减少，上调Rac1表达则丝状伪足数增多。罗丹明标记的鬼笔环肽定量实验结果显示，上调Rac1表达时子宫颈癌细胞F-actin蛋白的表达明显升高，提示miR-101通过Rac1抑制子宫颈癌细胞丝状伪足形成，从而抑制子宫颈癌细胞转移。

本实验结果显示，miR-101在子宫颈癌患者血清中低表达，并与子宫颈癌分化程度有关，提示miR-101可能成为判断子宫颈癌分化程度的分子指标。miR-101通过靶向下调Rac1表达抑制子宫颈癌细胞丝状伪足形成，从而抑制子宫颈癌细胞的侵袭及转移，为子宫颈癌转移机制的研究提供了新思路。