外泌体在癫痫炎症反应中的作用

徐圣洁 吴涛 郭子正 王中琳

癫痫是一种突发性大脑神经元高度同步化反复异常过度放电引起短暂性脑功能失调的慢性大脑疾病[1]，中枢神经系统(central nervous system，CNS)内特定区域的炎症反应是癫痫的共同特征之一[2]。由于癫痫发作时，谷氨酸受体过度激活、氧化应激、促炎细胞因子升高等均可破坏血-脑屏障(blood brain barrier，BBB)，故CNS内部的炎症反应以及外周循环中的炎症反应均可诱发癫痫。外泌体作为介导细胞间通讯的一种新载体，已被大量研究证实其能通过抑制胶质细胞激活、参与免疫应答等途径减轻炎症反应，降低神经元敏感性，控制癫痫发作。此外，外泌体所独有的脂质双层结构和穿越BBB的能力，可成为给药载体，在癫痫的治疗中发挥作用[3]。

尽管目前癫痫的诊治途径有多种，但仍有25%的患者被误诊[4]，约30%的患者癫痫发作难以得到良好的控制[5]，因此寻求新的诊治方案具有重要意义。外泌体成为近年来研究癫痫诊治的热点。现就外泌体在癫痫炎症反应中的作用研究进展进行综述。

1 外泌体概述

外泌体是一类直径约50～150 nm的细胞外囊泡(图1)，其内包含多种遗传物质、蛋白质和脂质，可在血液、尿液、脑脊液[6]等体液中被检测到。大量研究表明，外泌体可通过促进细胞间信号传递和调节细胞对外部环境的反应参与许多生理病理活动[7]，并在多种神经系统疾病的发病中发挥重要作用。Ge等[8]研究发现小胶质细胞外泌体 miR-124-3p 通过靶向 Rela/ApoE 信号通路减轻神经变性；Kuwano等[9]研究认为神经源性外泌体中的IL34/CD81可能是重度抑郁症患者的重要生物标志物；Zhang等[10]在大鼠局灶性脑缺血模型中发现外源性外泌体可与受体细胞相互作用，间接促进受损神经修复；Thomi等[11]研究结果提示外泌体在围生期脑损伤中具有抗炎作用。此外，亦有研究发现采用脑转移细胞的外泌体预调节脑微环境可增强癌细胞的生长[12]。

图1 外泌体的形成以及介导细胞间联系的方式

2 外泌体与癫痫炎症反应

外泌体作为一种新型的细胞通讯载体，可以抑制炎症反应，调节相关蛋白的表达，包括促炎细胞因子如白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和抗炎细胞因子等，外泌体通过与神经系统靶细胞特异性结合，减少神经元脱失等方式参与CNS神经炎症调控[13]。另外，外泌体能够穿过BBB，直接将微小核糖核酸(microRNA)、药物、蛋白质等活性物质递送到大脑，可能成为治疗癫痫的潜在递送系统。

2.1 抑制胶质细胞激活胶质细胞激活是癫痫炎症反应的主要特征。多项研究证实外泌体可以抑制胶质细胞的激活。

2.1.1星形胶质细胞与外泌体：星形胶质细胞增生比小胶质细胞更持久，因此在炎症反应中造成的危害更大。星形胶质细胞具有营养神经、保护神经、维持细胞外离子平衡、跨突触传递信号以及参与形成BBB等作用[14]，而CNS受损后，星形胶质细胞大量增生，随之出现谷氨酸兴奋性毒性、细胞缝隙连接改变和线粒体功能障碍等异常表现。

Xian等[15]采用间充质干细胞来源的外泌体治疗毛果芸香碱诱发的癫痫小鼠模型时发现，与脂多糖组比较，外泌体处理组小鼠双侧海马组织中胶质纤维酸性蛋白和补体3相对表达水平降低，TNF-α和IL-1β的分泌显著减弱，且Ca2+内流显著减少，小鼠空间和记忆障碍得到恢复，提示外泌体能够改善反应性星形胶质增生、炎症反应、异常钙信号和线粒体功能障碍，并减轻癫痫持续状态(status epilepticus，SE)诱发的学习和记忆障碍。间充质干细胞来源外泌体能够通过调节核因子-E2相关因子2(Nrf2)-核转录因子κB(NF-κB)信号通路，抑制星形胶质细胞激活，以减轻炎症损伤。Nrf2与NF-κB相互作用会导致神经炎症和氧化应激。Nrf2是一种由炎症作用引发的氧化损伤的调节因子，在炎症或氧化应激下，可以启动抗氧化基因的转录和相应蛋白质的合成[16]。NF-κB激活能够驱动免疫反应，包括胶质细胞增生、白细胞浸润和促炎细胞因子的产生。有研究认为，外泌体通过上调Nrf2表达和核易位，以及降低NF-κB活性阻止星形胶质细胞的激活[15]；靶向反应性星形胶质细胞是控制癫痫发作的潜在治疗方案[17]，在炎症过程中外泌体可诱导两种不同类型的反应性星形胶质细胞(即A1和A2)，反应性星形胶质细胞持续增生会刺激促炎细胞因子产生和释放，并促进炎症刺激后胶质细胞增生和神经元脱失的扩散[18]。与正常星形胶质细胞比较，A1星形胶质细胞具有破坏突触[19]以及神经元毒性的作用。在调节Nrf2-NF-κB信号通路的过程中，外泌体不仅可抑制反应性星形胶质细胞的增生，甚至还可将A1催化转变为增生前的星形胶质细胞。线粒体功能障碍是众多神经变性疾病的基础[20]，主要表现为线粒体钙离子处理异常。间充质干细胞来源的外泌体通过恢复线粒体膜电位而改善线粒体功能障碍，减少星形胶质细胞Ca2+内流，逆转海马结构区星形胶质细胞的异常钙信号。

相对于间充质干细胞，间充质干细胞来源的外泌体能携带mRNA、microRNA和蛋白质等抗炎因子，免疫原性较低，更易储存和管理，外泌体或外泌体装载药物靶向海马结构的星形胶质细胞或可能成为癫痫新的治疗方案。

2.1.2小胶质细胞与外泌体：研究证明[21]小胶质细胞激活的程度与癫痫的持续时间呈正相关。小胶质细胞作为大脑中重要的免疫细胞，在调节神经炎症的过程中起着举足轻重的作用[22]。SE会导致神经变性、海马组织炎症、BBB破坏等，这与多种促炎细胞因子浓度增加和小胶质细胞激活密切相关。

Long等[23]研究发现小鼠SE后给予骨髓间充质干细胞来源A1外泌体治疗可有效减少神经变性疾病的发生，减轻慢性期海马组织炎症，维持正常神经发生和认知记忆功能。SE后谷氨酸水平升高及其引发的持续的神经炎症[24]是导致认知和记忆功能障碍的主要原因，大量谷氨酸作用于突触后膜的谷氨酸受体，引发兴奋性神经毒性，导致神经元细胞凋亡[25]。同时在癫痫发作过程中γ-氨基丁酸(GABA)受到抑制。维持谷氨酸与GABA之间的平衡是控制癫痫发作的潜在方案，A1外泌体可保护海马结构区的谷氨酸能神经元(兴奋性)和GABA能中间神经元(抑制性)，使谷氨酸与GABA维持相对平衡，控制癫痫发作。小胶质细胞能吞噬、清除细胞碎片，释放抗炎因子和神经生长因子，减轻神经损伤、促进修复。然而小胶质细胞高度活化时，会释放促炎因子及细胞毒性物质，造成神经元脱失。SE小鼠经A1外泌体介导治疗后其海马组织小胶质细胞激活受到抑制，多种促炎细胞因子如TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1等表达水平降低，抗炎细胞因子如IL-10、IL-6等表达增强。炎症及其介导的氧化应激与神经元脱失关系密切，海马结构区持续放大的炎症反应使机体氧化应激水平升高，而活性氧自由基又可通过调节神经元之间的突触与非突触通讯，导致神经炎症和细胞凋亡，使机体出现认知障碍和记忆丧失。SE后，新生的颗粒细胞异常迁移到齿状回的门区，而Reelin(一种分泌型细胞外基质糖蛋白)可以介导其向颗粒层迁移。A1外泌体通过保护Reelin中间神经元，减少异常神经网络的形成[23]。总之，A1外泌体可通过维持谷氨酸与GABA之间的平衡、抑制小胶质细胞激活、保护Reelin中间神经元等途径减少SE引起的神经变性、神经炎症以及认知和记忆障碍；SE终止后的短时间内给予A1外泌体有利于阻止SE向慢性癫痫转变。

2.1.3少突胶质细胞与外泌体：少突胶质细胞是一种重要的CNS髓鞘形成细胞，在脱髓鞘疾病中，少突胶质细胞受炎症微环境的影响会大量凋亡，严重影响髓鞘再生[26]。癫痫发作常与CNS脱髓鞘病变同时出现[27]，其原因主要与脱髓鞘病变导致自主神经功能异常有关。

Pusic等[28]采用用低水平的干扰素-γ刺激树突状细胞发现，其释放的外泌体含有能够增加基线髓鞘形成、降低氧化应激和恢复脱失髓鞘的微RNA，如miR-219(影响髓鞘生成)、miR-17-92(恢复脱失髓鞘)、miR-181a(抑制促炎信号)、miR-124(促进抗炎信号)等，外泌体内多种miRNA的协同作用是髓鞘形成以及再髓鞘化的必要条件；此外，研究发现该外泌体优先被少突胶质细胞(72%)摄取，其次是被小胶质细胞(34%)和星形胶质细胞(12%)摄取，提示IFN-γ刺激树突状细胞后释放的外泌体主要通过靶向少突胶质细胞以减轻脱髓鞘病变[28]。树突状细胞释放的外泌体中含有大量miR-219，并通过靶向调控NeuroD1、PDGFRa、ELOVL7等参与调节少突胶质细胞的分化以及髓鞘再生[29]。进一步探索此类外泌体与少突胶质细胞之间的作用机制，使其特异性靶向于少突胶质细胞，有利于实现少突胶质细胞最大限度地再髓鞘化。

2.2 参与免疫应答免疫反应与癫痫的发生、进展有密切关系[30]。炎症反应实际上是免疫应答中的一个暂时状态，免疫细胞和炎性因子在炎症反应中发挥关键作用：一方面，炎症局部有大量免疫细胞的浸润，激活后的免疫细胞会释放某些促炎症因子(如TNF-α、IL-1β等)，加重炎症反应；另一方面，免疫细胞也会释放抗炎因子(如IL-10等)，促进炎症反应消退。

正常情况下BBB可以隔离脑组织与免疫系统。在免疫应答的过程中，炎症反应通过多种机制破坏内皮细胞使BBB通透性改变，导致神经元细胞敏感性提高，癫痫发生阈值降低[31]，适度的炎症反应会促进CNS的代谢以及神经元突触重建，而当炎症反应进一步加剧时，可导致癫痫发作。神经兴奋性增加，BBB受损，可诱发癫痫发作。外泌体在调节免疫反应中发挥重要作用，如抗原呈递[32]、免疫抑制[33]、免疫监视[34]、免疫活化以及调控细胞间信息传递等。如间充质干细胞来源的外泌体能上调IL-10等炎症和免疫抑制因子的表达，促进调节性T细胞增殖，产生免疫抑制作用。

3 外泌体及其内容物可能成为癫痫的生物标志物

不同细胞来源的外泌体大约包含11261种蛋白质、2375种mRNA和764种miRNA[35]，其内容物的多样性与复杂性为外泌体成为癫痫的生物标志物奠定了基础。研究结果显示，某些miRNA的缺失会导致癫痫的发生，如miR-128是神经元兴奋性的关键调节剂，其表达的减少可引起致命性癫痫的发生[36]。

癫痫发生时，外泌体miRNA在血清中的表达发生变化。Wang等[37]通过对117例癫痫患者和112名健康人群进行分析发现，癫痫患者血清中有6种miRNA显著失调，即let-7d-5p、miR-15a-5p、-194-5p、-106b-5p、-130a-3p和-146a-5p。在诸多miRNA中，miR-106b-5p敏感度高达80.3%，特异度达81.2%，有望成为新的生物标志物。另外，Batool等[38]研究发现SE 2周后，癫痫小鼠外泌体分泌仍处于较高水平。

4 外泌体与癫痫的治疗

目前癫痫的治疗以抗癫痫药物治疗为主，例如苯妥英钠、卡马西平和丙戊酸钠等。尽管目前已有约30种不同分子靶点的抗癫痫药物可用，但在癫痫治疗中仍然面临许多挑战，如耐药性[39]、副作用[40]等，近1/3的癫痫患者病情得不到完全控制。

BBB是影响抗癫痫药物作用的一个巨大障碍。在脑靶向递送[41]中，外泌体既可通过自身参与神经细胞间信息传递影响炎症反应与免疫应答，又可通过内吞或受体介导与药物结合，使其高效渗透BBB，绕过P-糖蛋白药物泵出系统，实现药物的稳定长效。既往研究主要集中在外泌体自身及其携带的miRNA在癫痫炎症反应的作用[15，23]，目前尚未检索到有关外泌体作为给药载体治疗癫痫的临床研究，但可以从其他CNS变性疾病中获得启发，如Haney等[42]采用鼻腔给药的方式将装载过氧化氢酶的外泌体注入小鼠体内，并在小鼠脑内成功检测到大量装载过氧化氢酶的外泌体。这些外泌体不仅能有效避免免疫排斥反应，还展现出保护神经的作用。姜黄素的主要作用是清除自由基、抗炎、降血脂和抗聚集[43]，但其吸收差、代谢快，生物利用度很低。Kalani等[44]将姜黄素装载进小鼠胚胎干细胞来源的外泌体中，发现姜黄素的生物利用度明显提高，并且可通过降低小鼠大脑中胶质纤维酸性蛋白的表达以减少星形胶质细胞增生。

综上所述，目前尽管针对外泌体的研究尚处于起步阶段，但已有研究证实外泌体能通过抑制胶质细胞激活、参与免疫应答等途径有效减轻癫痫炎症反应，从而控制癫痫发作。但此过程所涉及的一些信号通路较为复杂，具体机制仍有待研究。从研究现状来看，外泌体广泛应用于癫痫的诊断与治疗仍存在较大困难，如何大规模开发和高效利用外泌体[45]是一个亟待解决的问题，如何保证外泌体携带的有利蛋白、miRNA以及药物能够定向、定量地到达受损组织也是一个巨大挑战。理论与临床应用之间是反复的实践过程，大量研究证实外泌体是诊断和治疗癫痫的潜在方案，因此深入研究外泌体减轻炎症反应的机制，对于控制癫痫发作具有重要意义。