植物内生菌多样性及其病害生防机制研究进展*

巫 艳，周云莹，朱玺燊，张力敏，SAUBANMUSA Jibril，杨志兵，王 一，李成云

(云南农业大学 植物保护学院，云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201)

植物是地球上有机物最主要的初级生产者，其叶际和根际为多种微生物(包括细菌、真菌、古菌、原生生物、线虫和病毒)的生长和繁殖提供了全球分布最广和十分独特的栖息地[1]。这些微生物可与植物形成结构和组成复杂并处于动态变化的功能共生体(pholobiont)[2]。与人类肠道中的微生物组类似，植物微生物组对植物的生长、繁殖和健康发挥着重要作用，被看作植物的第二基因组或延伸的基因组[3]。植物微生物组包括植物表面微生物(epiphyte)和内生菌(endophytes)，其中植物内生菌作为植物微生物组居住在植物组织内的子集，与植物的相互依赖性更为密切。可培养性的内生菌可用于评价其活体内外的代谢和功能，也可用于直接评价微生物组成员之间的互作及其对寄主功能的影响，在农业生产和医药领域都备受关注。

植物内生菌能够在所有可接触到的植物组织中定植，一些成员能够通过气孔和水孔直接浸染植物组织内部，一些则从受伤组织(包括刺吸式昆虫传播)进入植物维管组织并形成生物被膜黏附在植物的木质部和韧皮部等不同部位[4]，但这些生活于健康植物各种组织和器官内的微生物无论是生活史的某一阶段或全部阶段均不会对植物产生明显的负面影响[5]。起初主要采用可培养法研究内生菌，随着高效低成本的第二代DNA 测序技术(next-generation sequencing，NGS)的进步，结合多组学技术和生物信息学的发展，各种生境的微生物“暗物质”被逐步揭示，并通过不断提高的时空分辨率揭示微生物组的结构和功能多样性[6]。截至目前，能够分离并进行可培养的微生物仅占环境微生物的0.1%～1.0%[7]，随着培养组学技术的不断进步，可培养的微生物数量将快速更新。本研究对单、双子叶植物内生菌已有文献进行统计整理，分析单、双子叶植物内生菌的多样性，并概括植物微生物组在病害防治中的应用，以期为植物内生菌的深入研究提供理论参考。

1 单、双子叶植物内生菌的多样性

1.1 单、双子叶植物内生菌的群落组成

已有研究显示：所有植物中都存在内生菌，且在植物的根、茎、叶、花、果实、种子等各种器官中都有分布[8]。早期对双子叶植物内生菌的研究更多地集中在经济或药用植物，而对单子叶植物内生菌的研究主要集中于禾本科作物和草地植物。宏基因组学研究的结果表明：植物微生物组的多样性远超预期，推测其总数达到数百万种[6]。CITLALI 等[9]、ZARRAONAINDIA 等[10]和HAMONTS 等[11]对仙人掌科植物、葡萄和甘蔗等不同类型植物的研究发现：植物内生细菌群落主要以变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)为主，二者合计占比高达60%以上[1]。

对双子叶植物内生菌的文献进行检索、统计和分析，结果显示：有124 种双子叶植物通过可培养法分离内生细菌，其内生细菌群落主要以变形菌门、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门为主，拟杆菌门(Bacteroidetes)占比较小(图1a)；有65 种，单子叶植物通过可培养法分离内生细菌，且主要以放线菌门和变形菌门为主，而拟杆菌门和厚壁菌门占比较小(图1b)。通过可培养法分离内生真菌的双子叶植物有65 种，单子叶植物有40 种，且均以子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)及半知菌亚门(Deuteromycotina)为主(图1c 和图1d)。

图1 双子叶植物和单子叶植物的内生菌进化树Fig.1 Evolutionary tree of endophytes in dicotyledons and monocotyledons

1.2 单、双子叶植物内生菌种类的分布特点

对检索到的单子叶植物和双子叶植物内生菌相关文献进行进一步分析发现：门水平上，细菌以变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主，真菌以子囊菌门和担子菌门为主。属水平上，单子叶植物和双子叶植物共有的内生细菌有221 属，其中，假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、泛菌属(Pantoea)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、伯克氏菌属(Burkholderia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、链霉菌属(Streptomyces)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)的分离频率较高；单子叶植物和双子叶植物共有的内生真菌有75 属，其中，链格孢属(Alternaria)、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、丝核菌属(Rhizoctonia)、青霉属(Penicillium)和木霉属(Trichoderma)的分离频率较高。从统计结果来看，双子叶植物有细菌345 属、真菌229 属，单子叶植物有细菌536 属、真菌270 属，单子叶植物中的内生菌种类较多。

本研究统计得到单子叶和双子叶植物的内生菌共计细菌495 种(分属175 属)、真菌273 种(分属199 属)。由表1 可知：单子叶植物特有内生细菌的寄主主要是禾本科作物，如水稻、玉米和香蕉等；双子叶植物特有内生细菌的寄主多集中于草本植物，如苜蓿、大车前和月见草等。单子叶和双子叶植物共有的内生细菌寄主分布范围最广的前10 属内生细菌分别是鞘氨醇单胞菌属、链霉菌属、黄单胞菌属、根瘤菌属、假单胞菌属、泛菌属、类诺卡氏菌属、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)和芽孢杆菌属，其中鞘氨醇单胞菌属分布于30 多种植物，链霉菌属分布于80 多种植物，假单胞菌属分布于30 多种植物，这些内生细菌广泛分布于禾本科植物以及一些药用植物，表明这些种类能够适应多种植物形成的生态位。随着研究的深入，其寄主植物的种类可能会增加。

表1 单子叶植物和双子叶植物特有的寄主范围分布最广的前10 属内生细菌Tab.1 Top 10 endophytic bacteria genus with the widest host range distribution specific to monocotyledons and dicotyledons

由表2 可知：单子叶植物特有的内生真菌主要分布于禾本科和兰科植物，如剪股颖和小麦等；双子叶植物特有的内生真菌主要分布于一些药用草本植物，如桃儿七、小连翘和重阳木等。单子叶和双子叶植物共有寄主分布较广的前10属内生真菌为链格孢属、青霉属、曲霉属、出芽短梗霉属(Aureobasidium)、被孢霉属(Mortierella)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、丝核菌属、拟茎点霉属(Phomopsis)和隐球菌属(Cryptococcus)，其中，青霉属、链格孢属和曲霉属的寄主植物达20 多种，包括禾本科植物和乔木等。

表2 单子叶和双子叶植物特有的寄主范围分布最广的前10 属内生真菌Tab.2 Top 10 endophytic fungal genus with the widest host range distribution specific to monocotyledons and dicotyledons

1.3 单、双子叶植物中不同部位的内生菌差异

植物的不同部位(根、茎、叶和种子)都能分离得到内生菌，且不同部位的内生菌在结构与数量上存在差异。内生菌主要从植物的根部向地上部分运输，因此，根部的内生菌数量最多，茎、叶中的内生菌数量较少[12]。通过对可培养法和免培养法获得的双子叶植物内生菌在各个部位的分布情况进行分析发现，各部位的内生菌在门水平上主要以变形菌门、放线菌门和厚壁菌门为主(图2)。在属水平上，根部有内生细菌271 属，茎部有258 属，叶部有227 属，种子有123 属；根部有内生真菌143 属，茎部有140 属，叶部有126 属，种子有16 属。根、茎、叶和种子共有的内生细菌和内生真菌分别为66 和12 属，表明能适应不同生态位的内生细菌更多一些。

图2 双子叶植物中内生菌在各部位的分布情况Fig.2 Distribution of endophytes in dicotyledons at various sites

由图3 可知：单子叶植物根、茎、叶和种子的内生细菌主要为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。在属水平上，根部有内生细菌285 属，茎部有349 属，叶部有119 属，种子有69 属；根、茎、叶和种子中的内生真菌分别有125、139、56 和46 属。根、茎、叶和种子共有的内生细菌和内生真菌分别为32 和8 属。真菌和细菌在不同部位的分布特点与双子叶植物相似。

图3 单子叶植物中内生菌在各部位的分布情况Fig.3 Distribution of endophytes in monocotyledons at various sites

已有研究表明：多数内生菌具有宿主专一性和组织专一性，可能是由于不同的内生菌具有利用不同基质的能力，从而决定内生菌具有不同的生活方式[13]。同时，在不同宿主植物中内生菌的种类也不同，且同一宿主植物内生菌的数量和种类会随植物发育的龄期及植株不同部位而变化[14]。在单子叶和双子叶植物中，不同部位微生物的分离频率不同，如芽孢杆菌属、假单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属等在根中的分离频率高于茎、叶及种子，且数量最多，这些微生物以提高植物的生物和非生物逆境抗性为主要特点，通过抑制病原微生物的生长而促进植物健康生长，减轻作物的干旱、热和盐胁迫等[11]。在花生的不同器官中发现：其根部内生菌的多样性最高，其次是茎和叶，而花部所含的内生细菌种类最少[15]。一些

植物共有内生菌如芽孢杆菌属、链霉菌属和鞘氨醇单胞菌属等数量相对较多，这些菌存在于植物的不同部位，说明其能适应植物的不同生态位。通过可培养法和免培养法获得的内生细菌和内生真菌，从其不同部位分布情况来看，不同类群在不同部位的占比有所差异，这是由于不同部位有其独特的生态位，不同的生态位会选择性地过滤或招募特定的微生物类群，从而与寄主植物互作形成稳定的共存群落[16]。

通过上述分析发现：不同内生菌在不同寄主中存在一定差异，一些内生菌能够适应多种寄主植物，特别是青霉属、链格孢属、曲霉属、鞘氨醇单胞菌属、链霉菌属和黄单胞菌属等内生菌能够跨界适应单子叶和双子叶植物，这类内生菌是今后建立植物与微生物互作模型的优选物种，可通过这些物种更好地分析内生与外生的转换机制以及内生菌与附生菌的互作及其对寄主植物的影响，也可以更好地揭示寄主植物对内生菌和附生菌的调控机制。

2 植物内生微生物组在病害防治中的应用

与植物病害发生关系一直是植物内生微生物组研究的热点问题之一。植物病害的发生无疑会影响植物内生微生物组的变化，使患病植株与健康植株的微生物组存在显著差别。GAO 等[17]通过对健康与患病辣椒(Capsicum annuumL.)各个部位微生物群落开展系统分析发现：健康与患病植物的群落组成、构建、共现网络以及功能都存在差异。

2.1 植物内生微生物组与植物病害的关系

将番茄抗青枯病菌(Ralstonia solanacearum)品种与感病品种相比，抗病品种根际中含有更丰富的黄杆菌(Flavobacterium)基因组；与感病菜豆品种相比，抗尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的菜豆品种微生物组中假单胞菌(Pseudomonadaceae)和芽孢杆菌(Bacillaceae)的丰度较高，其根际的抗真菌活性明显增高。这些研究结果表明根际微生物是寄主抗病性的重要组成部分。一些植物还会在受到胁迫后向微生物“呼救”[18]，快速招募有益微生物对抗有害生物。植物也可以通过改变其基因表达模式，在其根际分泌有益于微生物的次生代谢产物，如拟南芥可通过提高根特异的转录因子MYP72 和β-葡萄糖苷酶编码基因PGLU42的表达水平，调节合成并分泌香豆素抑制病原菌，促进根际细菌繁殖，同时提高寄主的诱导系统抗性。内生微生物组成员之间还会通过联合行动共同抵御病原菌，如当拟南芥受到白粉病菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)侵染后，黄单胞菌属、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和微杆菌属(Microbacterium)的细菌丰度会同时显著增加，将这些微生物的复合物活体接种到拟南芥中，可促进拟南芥抗病。

微生物之间的互作分析可进一步揭示内生微生物组的变化与病害发生的直接关系。受粉状白粉菌(Erysiphe alphitoides)感染的橡树(Quercus robur)微生物组中，白粉病菌与许多微生物，尤其是与细菌之间都呈相互抑制或竞争的对立关系[19]，这反映出病原菌侵染会打破植物体内微生物群的稳态，使微生物之间的互作关系发生改变，也暗示适时地强化与病原菌有强烈抑制作用的微生物种群能够有效抑制病原菌生长和繁殖的潜力。DURAN 等[20]研究证明：植物微生物组内细菌与真菌之间的跨界互作可以达到显著抑制病原真菌和卵菌种群的数量，并减轻由后者引发的植物病害，进一步证明寄主植物可通过调控微生物之间的关系提高免疫能力，该机制是今后应用微生物进行植物健康管理的关键。

2.2 内生微生物对抗病原菌的防治机制

内生微生物对病原菌的生物防治涉及多种机制，如竞争排斥、抗菌和诱导寄主免疫反应等。其中，诱导寄主对病原菌入侵免疫的机制近年来取得不少新突破，如通过释放群体猝灭分子诱导寄主产生免疫能力[21]。在大多数病原菌中，致病性由群体感应的微生物细胞间信号调节[22]，如酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactone，AHL)分子存在于许多革兰氏阴性细菌和阳性细菌中，主要用于2 种细菌间的信息交流[23]。此外，具有群体淬灭活性的叶际微生物可通过降解广泛的群体感应信号分子抑制病原菌毒力基因表达，从而抑制病害发展[24]，如烟草内生微生物中发现的不动杆菌属、芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysnibacillus)、类香味菌属(Myroides)、假单胞菌属和沙雷氏菌属(Serratia)等[25]就属于具有群体淬灭能力的细菌属。

一些微生物产生的挥发性有机化合物(volatile organic compounds，VOC)能够帮助寄主提高对病原菌的防御能力。这类植物微生物组成员释放的VOC 既可以直接抑制植物病原菌，也可启动植物抗病反应的信号。已证明VOC 中的一些萜类化合物对植物抵御病原菌具有重要的防御作用[26-27]，如出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株L1 和L8 在活体外和活体内均可抑制灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)和青霉属等多种病原菌[28]，其潜力值得挖掘。

一些微生物可通过改变抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、过氧化物酶(catalase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)[29]等抗氧化酶的水平维持寄主植物的系统抗性，如通过加速防御相关酶(β-1,3-葡聚糖酶和POD)的活性促进花生(Arachis hypogaea) IAA 介导针对腐烂病原菌——黑曲霉(Aspergillus niger)的防御反应[30]。

有些微生物具有产生无毒基因产物(如细菌病原菌的III 型分泌物)的代谢能力，而一些微生物则通过产生麦角甾醇、β-葡聚糖和几丁质片段等信号物质诱导和增强寄主植物对病原菌的防御能力[31]。可见，植物内生微生物组中的微生物诱导植物局部和系统反应的机制还包括对特定防御途径的重编程，如VOC 的产生、群体淬灭、植物抗氧化状态的激活和无毒基因产物的产生等。

微生物组内的一些成员通过与病原微生物竞争生存空间和营养也能控制植物病害的发生[32-33]。INNEREBNER 等[33]研究表明：拟南芥植株中的鞘氨醇单胞菌可与丁香假单胞菌竞争果糖、葡萄糖和蔗糖等糖类物质，从而限制病原菌生长，但甲基杆菌不能通过利用这些糖类物质而达到抑制病原菌生长的目的，这表明对一些病原菌的竞争性驱逐取决于植物内生微生物组中是否存在高度专化的竞争者。可见，系统分析植物内生微生物组对抗病原菌的快速响应机制能够有效抑制病原菌的侵染和繁殖，进而减少病害的发生和危害。

3 展望

植物内生微生物组是一类应用前景广阔的资源微生物，植物与植物微生物组的互作研究也将是未来探索物种间互作机制的重要领域。在与宿主植物共生过程中，植物内生微生物组对促进植物的生长、提高植物的抗逆能力等表现出巨大潜力，且在医药方面也具有很高的开发价值。随着培养组学技术的进步，可培养微生物的种类和比例不断提高，将为微生物组和植物功能共生体的种群结构、动态演替和功能研究提供便利。未来研究的重点将聚焦于：结合可培养与免培养技术，利用可培养的物种建立模型以便于更有效地揭示不可培养微生物的功能；开发内生菌高灵敏度分子标记，精确分析其内生与外生的转换开关；内生菌与附生菌物质流、信息流和能量流及其对寄主植物的影响以及寄主植物对这些微生物种群结构的调控机制等。

展望未来，在充分揭示功能共生体的基础上，借助机器学习、人工智能和信息技术探索不同微生物之间互作的多级营养关系以及复杂的互作网络对寄主的影响，以期在农作物育种计划中设计整体功能协调、促进植物健康生长、资源利用效率更高的功能共生体，从而充分发挥其微生物功能，减少化学品投入和温室气体排放，实现农业的可持续发展，这也是研究植物微生物组的主要目标。