德宏奶水牛PRL 基因克隆、分子特征及组织差异表达分析*

谷丽娇，黄丽鸽，盛 丹，范新阳，苗永旺

(云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201)

催乳素(prolactin，PRL)是一种蛋白类激素，其名称最早来自于对家鸽的研究，研究发现家鸽的嗉囊乳是因催乳素刺激嗉囊上皮细胞增生引起的，随后从兔腺垂体前叶分离提纯得到催乳素[1]。催乳素与生长激素(growth hormone，GH)和胎盘催乳素(placental lactogen，PL)同属于生长激素/催乳素基因家族[2]。哺乳动物PRL 的生物学功能主要与乳腺发育、启动和维持泌乳及乳蛋白基因的表达有关，并对乳蛋白、乳糖和乳脂等乳成分的合成起主要调控作用，与产奶量和乳成分呈正相关[3]。在奶牛泌乳期间，PRL 发挥“能量迁移”作用，能调节机体将肝脏、肌肉和脂肪等组织的营养和能量优先流向乳腺，用于乳脂和乳蛋白合成[4]。因此，PRL被列为与奶牛泌乳性状密切相关的重要候选基因。

普通牛PRL基因定位于23 号染色体，包含5 个外显子和4 个内含子，CDS 长690 bp，编码229 个氨基酸，1～30 位氨基酸组成信号肽[5]。有研究报道：PRL基因与奶山羊乳腺上皮细胞中乳蛋白、乳脂和乳糖含量有关[6]。WALL 等[7]给牛连续3 周注射少量催乳素后产奶量增加，而给泌乳奶牛注射催乳素的抑制剂溴麦角隐亭可使产奶量下降[8]。杜挺媛等[9]对广西水牛PRL基因进行克隆，其完整编码区长690 bp，编码229 个氨基酸，发现其编码区存在2 个核苷酸替换位点，分别为c.T430C 和c.T576G。袁峰等[10-11]在槟榔江水牛PRL基因编码区发现c.C109T 和c.G192A 两个核苷酸替换位点。

随着泌乳生物学研究逐渐深入，已有研究表明Janus 激酶-信号转导子与转录激活子(Janus kinases-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyci，mTOR)信号通路介导的生物学过程与乳蛋白合成密切相关[12-14]。德宏奶水牛是在云南省德宏州通过当地德宏水牛与国外引进的摩拉水牛和尼里拉菲水牛杂交形成的高代杂交群体，具有较高的河流型水牛血统(≥75%)，是进行泌乳性状研究的理想素材[15]。本研究以德宏奶水牛为研究对象，对水牛PRL基因进行分离鉴定、生物信息学以及泌乳期和非泌乳期的多组织差异表达分析，旨在揭示德宏奶水牛PRL基因的理化特性和生物学功能，为深入研究水牛PRL基因的功能及其参与的信号路径提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

用于基因分离鉴定的样品采自云南省德宏州芒市。选取4 头成年健康的雌性德宏奶水牛(约4 岁，第3 胎)，其中2 头处于泌乳高峰期(产后约60 d)，2 头处于干奶期(分娩前约60 d)。水牛屠宰后对心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑、瘤胃、小肠、肌肉和乳腺等组织进行取样，并立即保存在液氮中，直至进一步处理。所有组织样品进行总RNA 的提取，用于基因分离和组织差异表达分析。所有取样水牛的饲养条件一致。

1.2 总RNA 的提取和cDNA 的合成

使用RNAiso Plus 试剂盒(TaKaRa，中国大连)分离组织总RNA，用1.5%琼脂糖凝胶电泳对其完整性进行检测，用紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国)检测其浓度和纯度。使用Oligo(dT)18(500 μg/mL)和反转录试剂盒(TaKaRa，中国大连)合成cDNA。

1.3 水牛PRL 基因CDS 克隆及鉴定

1.3.1 引物设计与合成

以NCBI 数据库中水牛PRL基因的mRNA 序列(EF054878.1)为参考序列，设计用于扩增水牛PRL基因完整编码区及用于该基因表达谱分析的引物 (F：TTCCTGGTGAAGTGTGTTTCT，R：AATGTGGGCTTAGCAGTTG，退火温度58.8 ℃);以水牛ACTB基因序列(NM_001290932.1)设计用于半定量RT-PCR 的内参基因引物 (F：TCTTGGTCACCTCGTCGTC，R：GGCGCGATGATCTTGAT，退火温度60 ℃)。引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

1.3.2 PCR 反应及条件

以乳腺组织cDNA 为模板进行PCR 扩增。RT-PCR 反应体系为10 µL，包括上、下游引物各0.4 µL (10 μmol/L)，2×EsTaqMaster Mix 5 µL(康为，中国北京)，模板cDNA 1 µL (50 ng/µL)和ddH2O 3.2 µL。PCR 扩增程序为: 95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s、58.8 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s (35 个循环)，最后72 ℃延伸5 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增效果好的PCR 产物进行双向测序。

测序获得的序列采用SeqMan 和EditSeq 软件 (DNAStar Inc.，美国)进行序列核对并输出。经ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)识别确定开放阅读框，获得德宏奶水牛PRL基因CDS 序列；以该序列作为查询序列在NCBI 数据库中进行BLAST 同源搜索，确定所获得序列的基因属性。

1.4 分子特征、进化关系和分子功能分析

为确定水牛PRL基因转录区的结构特征，将其与其他9 个物种的同源区进行比较。牛科物种及鼠和人的PRL基因信息从NCBI 数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=) 下载的基因组注释文件获得，使用TBtools 中的GXF 功能修复PRL基因完整的转录区结构，采用在线软件Gene Structure Display Server (http://gsds.gao-lab.org/)对PRL基因的转录区结构进行可视化。通过Megalign 输出所有PRL 氨基酸序列的一致性。基于PRL 氨基酸序列，使用MEGA 7 软件的最大似然法(JTT矩阵模型)构建系统发育树[16]。将每个物种的PRL 序列提交到MEME (https://meme-suite.org/meme/) 网站进行保守基序的下载。将所有物种的PRL 序列导入NCBI 数据库的 Web CD-Serach (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sructure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)工具进行保守结构域的分析。将系统发育树、保守基序和保守结构域的结果输入到TBtools 的Gene Structure View (Advance)工具进行结果可视化。本研究克隆获得的德宏奶水牛PRL基因序列命名为Dehong Dairy buffalo (Dhd_buffalo)，与NCBI 数据库中 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)具有完整CDS 的牛科物种主要转录本序列进行比较，网上序列信息见表1。

表1 PRL 基因序列来源Tab.1 Sequence source of PRL gene

利用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)、SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)和 Compute pI/Mw tool (http://web.expasy.org/compute_pi/)分别预测PRL 蛋白的理化特征，包括疏水性、信号肽、跨膜区、理论分子量和等电点。利用在线软件SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html) 和 WISSMODEL (https://swissmodel.expasy.org/)同源建模方法分别对氨基酸的二级结构和三级结构进行预测。通过ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) 和 Prosite Scan (http://prosite.expasy.org/prosite.html)预测亚细胞定位和氨基酸修饰。使用InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/seach/sequence-search)、Uniprot (http://www.uniprot.org/)和DAVID (http://david.ncifcrf.gov/)进行蛋白质分子功能和生物学路径分析。

1.5 水牛PRL 基因组织差异表达分析

采用半定量RT-PCR 方法，以水牛ACTB基因作为内参 (内参引物见1.3.1 节)，检测德宏奶水牛PRL基因在泌乳期和非泌乳期心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、小脑、瘤胃、小肠、肌肉和乳腺等11 个组织的表达量。PCR 反应体系和反应程序与1.3.2 节的基因克隆相同。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用Quantity One 软件对组织表达谱检测胶图进行分析，得出相对表达量数据。基于该数据，采用Excel 软件构建基因表达谱柱状图。

2 结果与分析

2.1 水牛PRL 的克隆与鉴定

本研究得到750 bp 的PCR 产物(图1)，与预期结果相符。对获得的序列进行开放阅读框(ORF)识别，发现该序列的CDS 全长690 bp，编码229 个氨基酸(图2)。该CDS 序列与普通牛、野牛、牦牛、瘤牛、山羊、绵羊和藏羚羊PRL基因CDS 序列同源性均为99.6%，故确定所获序列为德宏奶水牛PRL基因序列。序列分析表明：水牛PRLCDS 区序列的A、G、T 和C 碱基含量分别为25.07%、23.77%、23.33%和27.83%，G+C的含量为51.59%。

图1 德宏奶水牛PRL 基因RT-PCR 产物Fig.1 RT-PCR product of Dehong dairy buffalo PRL gene

图2 本研究获得的德宏奶水牛PRL 基因CDS 区序列及对应的氨基酸序列Fig.2 Complete CDS of Dehong dairy buffalo PRL gene and its encoded amino acid sequence in this study

2.2 分子特征、进化关系和分子功能

2.2.1PRL基因结构

由图3 和表2 可知：在牛科物种中，每个牛科物种的PRL基因CDS 长度相同，外显子2、外显子3 和外显子4 的长度相同，转录起始位点和终止位点的位置不相同，5′UTR 和3′UTR 的长度不同，外显子1 和外显子5 的长度也不同。所有牛科物种含有5 个外显子和4 个内含子。

图3 PRL 基因转录区的结构Fig.3 The structure of PRL transitional region

表2 水牛与其他物种PRL 结构信息Tab.2 Structural information of PRL in buffalo and other species

2.2.2 PRL 蛋白的理化特征

由表3 可知：德宏奶水牛PRL 蛋白与其他牛科物种PRL 的基本理化特征相似性较高。德宏奶水牛PRL 蛋白为亲水的稳定蛋白质。预测表明：德宏奶水牛PRL 蛋白无跨膜结构，含有1 个位于N 端1～30 的信号肽，成熟肽由之后的199 个氨基酸残基构成。

表3 PRL 蛋白基本理化特征Tab.3 Basic physicochemical characteristics of PRL protein

2.2.3 水牛PRL 功能修饰位点

对德宏奶水牛PRL 蛋白功能修饰位点进行预测，结果显示：PRL 蛋白中潜在的功能修饰位点有5 种(表4)。

表4 水牛PRL 的功能修饰位点Tab.4 Function modification sites in buffalo PRL

2.2.4 基序、保守结构域和进化关系

由图4 可知：水牛与其他牛科物种的PRL 氨基酸序列一致性达97.4%以上。

图4 水牛与本研究其他9 个物种间PRL 的氨基酸序列一致性Fig.4 The consistency of PRL amino acid sequences between buffalo and other nine species in this study

对9 种哺乳动物的PRL 氨基酸序列基序和保守结构域进行分析，结果(图5)显示：牛科物种含有7 个基序，分别为motif1～motif7，人含有8 个基序，分别为motif1～motif5、motif7～motif9。水牛与其他牛科物种及人均含有1 个prolactin_like 保守结构域。牛科物种的prolactin_like 结构域(AA32～229)由motif1～motif4 和motif6～motif7组成，人的proactin_like 结构域(AA30～228)由motif1～motif4 和motif7～motif9 组成。水牛PRL 和其他牛科物种存在相同的基序和保守结构域，且每个牛科物种的结构域起始位置均为AA32～229，说明牛科物种PRL 蛋白之间功能相似。

图5 水牛与本研究其他9 个物种 PRL 的系统发育树、基序构成和保守结构域Fig.5 Phylogenetic tree,motif composition and conserved domain based on the PRL sequences of buffalo and other nine species in this study

基于PRL 氨基酸序列构建水牛及其他9 个物种的系统发育树，结果(图5)显示：水牛与其他牛科物种聚在一起。

2.2.5 PRL 二级结构的构成和三级结构

德宏奶水牛和普通牛PRL 蛋白的二级结构的构成如图6 所示。水牛PRL 蛋白的α螺旋、延伸片段、β折叠和无规卷曲含量分别为56.77%、1.75%、1.75%和39.74%，普通牛PRL 蛋白的α螺旋、延伸片段、β折叠和无规卷曲含量分别为59.39%、2.18%、3.06%和35.37%。德宏奶水牛和普通牛PRL 与模板大鼠PRL (3 npz.1.A)的序列一致性均为73.87%，覆盖率均为87%，覆盖区域也均为AA31～229，其保守结构域(AA32～229)完全在覆盖区域，德宏奶水牛PRL 的三级结构与普通牛的极其相似(图7)。

图6 德宏奶水牛和普通牛PRL 蛋白二级结构单位构成预测Fig.6 Prediction of the secondary structure composition of PRL protein in Dehong dairy buffalo and cattle

图7 德宏奶水牛和普通牛PRL 成熟肽的三级结构Fig.7 Tertiary structure of the mature peptide of Dehong dairy buffalo and cattle PRL

2.3 水牛PRL 的生物学过程和分子功能

预测表明：德宏奶水牛PRL 为分泌到细胞膜外的蛋白，属于生长激素/催乳素家庭成员。其参与负调控细胞凋亡(GO：0001973)、肽激素分泌(GO：0030072)、正调控脂肪酸合成(GO：00457-23)和正向调节基因表达(GO：0010628)的生物学过程；其分子功能主要是激素激活(GO：00-05179)和与催乳素受体结合(GO：0005148)；其参与的路径是细胞因子与细胞因子受体相互作用(GO：0007267)、神经活性配体与受体相互作用、PI3K-Akt 信号通路(GO：0014068)、JAK-STAT信号通路(GO：0046427)和催乳素信号通路。

2.4 水牛PRL 组织差异表达分析

由图8 可知：PRL基因在所检测的2 个时期的11 个德宏奶水牛组织中均有表达。其中，PRL基因在非泌乳期的脾脏中表达量最高，其次是肝脏和肌肉；在泌乳期的乳腺中表达量较高。PRL基因在肺脏、乳腺、瘤胃、小脑和小肠中的表达表现为泌乳期高于非泌乳期；在脾脏、肝脏、心脏、大脑、肌肉和肾脏中的表达则相反。

图8 德宏奶水牛PRL 基因组织差异表达Fig.8 Tissue differential expression of the PRL gene in Dehong dairy buffalo

3 讨论

本研究对德宏奶水牛PRL基因进行了分离鉴定，确定其PRL基因CDS 序列长690 bp，编码1 个由229 个氨基酸残基构成的多肽。PRL 蛋白属于生长激素/催乳素家族，本研究发现其含有1 个prolactin_like 结构域(AA32～229)。含有该结构域的蛋白主要功能为正调控动物泌乳。有研究表明：鸡和斑马鱼的prolactin_like 是催乳素受体(prolactin receptor，PRLR)的替代配体，prolactin_like 可以通过PRLR 在许多靶组织中发挥自分泌或旁分泌作用[17-18]。德宏奶水牛PRL基因的结构与其他牛科物种相似，其编码蛋白的二级结构组成和三级结构与普通牛也有很高的相似性。PRL 蛋白的基序和保守结构域在牛科物种之间高度保守。系统发育分析显示：德宏奶水牛与其他牛科物种聚为一类，揭示它们之间的PRL 功能更相似。基于水牛PRL基因转录区结构、其编码蛋白基序和保守结构域分析，揭示PRL 在水牛与其他牛科物种中的功能一致。

研究发现：乳蛋白合成的2 条主要信号通路为JAK-STAT 通路和磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白(sphatidylinositol 3-kinase-AKT serine/threonine kinase-mammalian target of rapamyci，PI3K-AKT-mTOR)信号通路[19]。本研究预测显示：PRL 参与了JAK-STAT 和PI3KAKT-mTOR 信号通路。JAK2-STAT 信号通路是在催乳素作用下酪蛋白合成转录水平的重要途径之一[20]。PRL 通过与PRLR 结合，启动JAK-STAT信号途径并激活反式作用因子STAT，使STAT作用于乳蛋白基因启动子区的靶序列，启动或增强乳蛋白相关基因的表达[21-22]。在牛乳腺组织中，PI3K-AKT-mTOR 信号通路控制着乳蛋白相关基因的翻译。催乳素也可以调节PI3K-AKT 信号传导途径，添加催乳素后 PI3K 的p85 亚基、PRLR的p95 亚基及胰岛素受体底物1 (insulin receptor substrate 1，IRS1)的p185 亚基的酪氨酸磷酸化增加，使PI3K 和IRS1 共同与PRLR结合，进而发挥其调节乳腺功能的作用[14]。本研究预测水牛PRL 蛋白正调控脂肪酸合成的生物学过程。研究表明：催乳素可极显著提高牛乳腺组织中与脂质合成相关基因的表达量[23]，与本研究的结果一致。研究发现：PRL 能激活奶牛乳腺上皮细胞中的 JAK2-STAT5 信号通路，进而提高乳脂和乳蛋白的合成[24]。体外细胞实验证实：在淋巴瘤细胞中添加PRL 可激活 PI3K-AKT 通路，被激活的AKT 能调节与蛋白和脂类代谢相关的转录因子活性，如固醇调节元件结合蛋白-1c (sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和mTOR 等，进而参与蛋白质和脂质合成[25]。本研究揭示水牛PRL 蛋白与其他牛科物种的PRL 蛋白功能相似，推测水牛PRL 在JAK-STAT 和PI3KAKT-mTOR 乳蛋白信号通路及乳脂合成过程中发挥重要作用。

蛋白质成熟的必要步骤是翻译后的修饰加工，而磷酸化修饰对蛋白的结构和功能具有重要作用，磷酸化修饰与细胞的信号转导和细胞周期等过程相关[26]。酪氨酸激酶介导细胞信号转导途径，参与PI3K-Akt 和JAK-STAT 通路，在细胞的代谢、分裂、分化、生物功能和死亡过程中起着重要作用[27]。酪蛋白激酶Ⅱ作为参与细胞信号转导的重要分子，通过对底物的磷酸化作用而影响细胞增殖和分化、细胞信号的转导和加工以及细胞凋亡[28]。N-肉豆蔻酰化位点是一种蛋白质脂质修饰位点，它在细胞信号传导、蛋白质相互作用以及蛋白质靶向内膜和质膜系统中起着重要作用[29]。本研究也预测到了这些修饰位点，但其在德宏奶水牛PRL 蛋白中的功能还有待研究。

研究表明：PRL在垂体、乳腺、淋巴、大脑、卵巢、肾脏和脾脏等组织中表达[30]。本研究所检测的德宏奶水牛泌乳期和非泌乳期11 个组织中均有PRL表达，说明该基因在多种组织中发挥作用。在本研究中，PRL基因在小肠中的表达量表现为泌乳期高于非泌乳期。在大鼠哺乳期诱导小肠中PRL的升高可增加肠道对钙的吸收，进而满足胎儿生长和母鼠产奶的钙需求[31]。还有研究报道：PRL基因在大鼠乳腺中表达，且持续整个泌乳期，在断奶早期PRL基因的表达开始下降，乳腺上皮细胞开始退化[32]。体外培养乳腺上皮细胞的研究表明：添加催乳素可以促进β-酪蛋白基因表达及β-酪蛋白合成[33]。缺少PRL基因可导致产奶量持续降低，乳腺泌乳细胞数量可在48 h 内减少20%～25%[34]。PRL在泌乳期乳腺中的表达量显著高于非泌乳期，表明该基因在泌乳期乳腺组织中发挥重要作用。在泌乳期PRL 表达水平变化激活STAT5a 及其信号途径，结果是降低奶牛乳腺上皮细胞凋亡并提高乳蛋白合成[35]。有研究显示：用催乳素处理奶牛乳腺上皮细胞，在催乳素质量浓度为200 μg/L 时能显著提高AKT、mTOR、糖体蛋白S6 激酶1、真核细胞翻译起始因子和β-酪蛋白的表达量[36]。PRL参与了JAK-STAT 和PI3K-AKT-mTOR 乳蛋白合成信号通路，推测德宏奶水牛PRL基因可能参与泌乳期乳腺上皮细胞中乳蛋白的合成。

4 结论

德宏奶水牛PRL基因CDS 长690 bp，编码1 个由229 个氨基酸残基构成的多肽，是含有1 个prolactin_like 结构域的膜外分泌蛋白。水牛PRL的转录区结构及其编码蛋白的理化特征、结构和保守结构域与其他牛科物种的一致性很高，说明PRL 的功能在水牛与其他牛科物种间高度保守。水牛PRL 无跨膜结构，含有1 个信号肽，其作为胞外蛋白与PRLR 结合发挥作用。PRL在水牛包括乳腺在内的多个组织中都有表达，推测该基因可能通过JAK-STAT 和PI3K-AKT-mTOR 信号通路参与德宏奶水牛的泌乳过程。