白蜡虫脂酰辅酶A 还原酶基因家族鉴定及序列分析*

柳 伟，安佳琪，高 熹 ，杨 璞,3

(1.中国林业科学研究院 高原林业研究所，云南 昆明 650224；2.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；3.国家林业和草原局，资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明 650224)

蜡酯在动物、植物和微生物中广泛存在，具有多种重要的生物学功能，其功能多与生存环境相适应[1]。蜡酯在植物中主要形成表皮蜡，可防止病菌和紫外线的侵害，还可以保护水分，或以高浓度的形式积累在一些种子油中[2]。动物蜡酯具有保护作用，如工蜂用分泌的蜂蜡筑巢，为自己提供庇护场所；还具有防水作用，如水禽用喙将尾脂腺分泌的蜡酯涂抹在羽毛上，使羽毛光润防水。蜡酯也是微生物中重要的储存脂类，各种细菌通过积累蜡酯将其作为主要的碳源和能量储存物质。蜡酯具有多种功能和性质，可作为人类生活中重要的经济油脂，广泛应用于医药、化妆品和食品工业，尤其是能源和化工等领域。

蜡酯由长链脂肪酸与长链醇通过酯化反应结合形成，其合成过程较为保守[1]。脂酰辅酶A 还原酶 (fatty acyl-CoA reductase，FAR) 将脂酰辅酶A 还原成相应的脂肪醇，然后与脂酰辅酶A 在蜡酯合成酶催化下形成蜡酯[3-5]。脂酰辅酶A 还原酶所催化的还原反应依赖NADPH。序列分析表明：动物和植物的FAR 较为保守，在N 端氨基酸有1 个长度约为300 aa 的NADPH 结合结构域，在C 端含有1 个Sterile 蛋白结构域[6-7]。

已有研究表明：FAR 催化生成的脂肪醇主要参与蜡酯、甘油三酯和信息素的合成[1]。同一生物体中有多个far基因，在不同组织的表达有不同的生理功能。拟南芥far3基因在叶、茎、花和根中均有表达，参与角质层蜡的合成[8-9]；拟南芥中far1、far4和far5在根的内皮细胞中表达，主要参与软木脂的形成；意蜂far1基因主要在蜜蜂头部表达，参与信息素或醚酯的合成[10]。

白蜡虫 (Ericerus pela) 是一种有巨大经济价值的资源昆虫，在雄虫二龄时期分泌大量白蜡。白蜡的主要成分是蜡单酯，占白蜡总量的93%～95%。在机械、化工、食品、农林和信息技术等领域应用广泛[11-12]，以白蜡为原料生产的高级烷醇也具有极大的药用价值[13]。FAR 在白蜡合成中起关键作用，但白蜡虫far基因家族缺少系统的进化分析研究。本研究对白蜡虫far家族基因进行鉴定，并进行序列特征分析，同时与其他物种中参与蜡酯合成的FAR 进行系统进化分析，以期为进一步探究白蜡虫蜡酯合成基因的特点与进化奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 far 基因家族鉴定和结构域分析

FAR 的结构域信息下载自Pfam 数据库(http://pfam.xfam.org/)，再利用HMMER 3.0 在白蜡虫蛋白库搜索含有far基因结构域的序列。为避免基因组注释有遗漏的far基因，从Uniport 数据库(https://www.uniprot.org/)下载FAR 蛋白序列，在白蜡虫转录组蛋白库中进行本地BLAST 搜索，由此获得白蜡虫转录组预测的FAR。结合白蜡虫转录组注释信息，将这些FAR 对应的转录本在白蜡虫基因组序列上进行本地BLAST 搜索，获得的序列作为far候选基因。此外，在Nr (nonredundant protein sequence)、Nt (nucleotide sequence)和Swissport 数据库中注释为FAR 的基因组预测基因同样作为far候选基因。将以上far候选基因上传到CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)进行结构域分析，得到2 种序列，一种包含2 个完整的FAR 结构域(即NADB Rossmann 结构域和FAR C 结构域)，另一种仅含有1 个FAR 结构域，对这些序列进行在线BLAST 分析，2 种方法都注释为FAR 的基因保留作为最终的候选far家族基因。

1.2 白蜡虫far 基因保守基序、基因结构和氨基酸序列属性分析

利用在线网站MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)[14]对白蜡虫FAR 蛋白保守基序进行分析，基序的最大数值设为15，基序的长度设置介于6～200 之间，其他参数使用默认参数。对得到的保守基序使用CDD 进行功能注释；使用在线网站GSDS 2.0 (http://gsds.gao-lab.org/)[15]分析内含子和外显子；使用ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)在线工具[16]对筛选的白蜡虫FAR 蛋白序列进行等电点和蛋白分子量等属性分析。

1.3 白蜡虫far 基因染色体定位

将far基因在scaffold 上进行定位，得到起始位置信息，使用在线网站MapGene2Chrom web v2 (http://mg2c.iask.in/mg2c v2.0/)[17]将所有白蜡虫far基因在染色体上的物理位置绘制成图。单个染色体宽度设置为100 px，染色体边界宽度为2 px，其他参数设置保持默认值。

1.4 白蜡虫far 基因的共线性Circos 分析

使用Mauve 2.3.0 软件对白蜡虫far基因进行共线性分析，参数和视图使用默认值。得到far基因的共线性区域，连接共线性较好的far基因；利用Circos 对共线性结果进行可视化。

1.5 系统进化树的构建

利用ClustalX 软件对白蜡虫far基因氨基酸序列进行多序列比对，然后将得到的结果导入MEGA 6.0 软件，使用邻接法(Bootstrap=1 000)构建系统进化树[18]；使用ClustalX 软件对不同物种的FAR (表1)进行多序列比对，在MEGA 6.0 中采用最大似然法(Bootstrap=500)绘制不同物种FAR蛋白进化树[19-20]。其中，拟南芥、西德蒙木和小鼠的FAR 来自NCBI；意蜂、果蝇、豌豆蚜和扶桑绵粉蚧的昆虫FAR 来自昆虫基因组与转录组数据库InsectBase (http://www.insect-genome.com/)。

表1 物种的FAR 信息Tab.1 FAR information for species

1.6 不同物种的far 基因共线性分析

为了进一步检测白蜡虫far基因与其他物种far基因[21-23]的共线关系，采用Mauve 2.3.0 软件进行共线性分析。参数设置和视图样式同1.4 节。

1.7 不同物种的FAR 相似性统计分析

为了探讨不同物种间FAR 序列的相似性，利用在线BLAST 计算每2 对FAR 序列之间的相似性，将统计结果导入在线网站Heatmapper (ht-tp://www.heatmapper.ca/expression/)，氨基酸与高、中、低值的相似性以红、白、绿三色表示，并根据统计结果进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 白蜡虫far 基因家族鉴定

根据转录组注释信息，197 条序列注释为far基因。利用197 个候选基因的转录本序列进行基因分析。一些基因被发现是同一基因的不同转录本。根据转录本在scaffold 中的位置，共鉴定出17 个基因。

根据基因组预测基因的注释信息，26 条序列注释为far基因。与转录组得到的序列进行比对，在白蜡虫far基因家族中有30 个far基因；其中有22 个具有2 个完整的结构域和合适的序列长度，可以进行后续分析。

2.2 保守基序、基因结构和氨基酸序列分析

对15 个保守基序(图1)进行分析，MEME分析结果显示：基序1～6、9、12 和14 属于NADB Rossmann 结构域，基序7、8、10 和13 属于FAR C 结构域。CDD 分析结果显示：基序1～4、9 和14 属于NADB Rossmann 结构域，基序8 和13 属于FAR C 结构域。MEME 分析与CDD 分析结果基本一致。此外，基序11 和15 位于域间区域，所有FAR 都包含基序11 或15，但二者并不同时存在于1 个FAR 中。

图1 白蜡虫FAR 保守基序分析Fig.1 Conserved motif analysis of FAR in Ericerus pela

白蜡虫far基因有6～11 个外显子、5～10 个内含子。外显子平均长度为145～225 bp，内含子平均长度为777～7 098 bp。Epfar-5包含10 个内含子和11 个外显子，数量最多(图2)。在22 条白蜡虫FAR 中，氨基酸序列长度为467～587 aa，仅有FAR-19 的等电点小于7。

图2 白蜡虫far 基因结构分析Fig.2 Gene structure analysis of the far genes in E.pela

2.3 白蜡虫far 基因染色体定位

图3 显示：22 个far基因分布在16 个重叠群(contig)上，contig113 的far基因最多(4 个)，其次 是contig1166 (3 个)，即contig113 和1 166 有far基因簇；contig683 有2 个far基因；其余13 个contig 上各有1 个far基因。

图3 白蜡虫far 基因在基因组上的分布Fig.3 Genomic distribution of the far genes of E.pela

2.4 白蜡虫far 基因的共线性Circos 分析

由图4 可知：22 个far基因共有11 个共线性模块。其中，far6 号基因与其他far基因有最多的共线性模块，与far5、9、13、18 号基因都有连线。far9 号有3 个连线。far2 号和27 号各有2 个连线。其余5 个基因只有1 个连线。

2.5 系统进化树

由图5 可知：白蜡虫的22 个far基因聚为2 类。第1 类有12 个far基因，聚为4 组；第2类有9 个far基因，聚为2 组。由图6 可知：不同物种的FAR 大多按所属物种的亲缘关系聚为3 类。白蜡虫的FAR 主要在第1 类，豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的FAR 主要在第2 类，扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis)的FAR 在第1、2 类中都有分布，第1 类中的FAR 基本与白蜡虫聚在一起。

图5 白蜡虫FAR 的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of FAR in E.pela

图6 8 个物种的FAR 的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of FAR in eight species

2.6 不同物种的far 基因共线性分析

由图7 可知：白蜡虫与扶桑绵粉蚧的共线性最好，二者之间的共线性连线最多，共线性模块覆盖率最高。白蜡虫far基因与小鼠、意蜂、豌豆蚜和黑腹果蝇far基因的共线性较差，共线性连线较少，共线性模块覆盖率较低。白蜡虫far基因与拟南芥和西德蒙木的far基因共线关系最差，几乎没有共线性连线。

图7 白蜡虫与拟南芥和扶桑绵粉蚧的far 基因共线性分析Fig.7 Synteny analysis of far genes among E.pela,Arabidopsis thaliana and Phenacoccus solenopsis

2.7 不同物种的FAR 相似性

由图8 可知：不同物种的FAR 的氨基酸相似性在25%～60%，高相似性 (50%～60%) 的FAR蛋白主要来自同一物种。拟南芥和西德蒙木的FAR 相似性约为50%；不同昆虫体内FAR 蛋白的相似性大多不高 (25%～40%)；具有泌蜡功能的FAR 氨基酸与其他物种的FAR 相似性仅为25%～40%。

图8 不同物种的FAR 相似性热图Fig.8 Heat maps of FAR similarity of different eight species

3 讨论

脂酰辅酶A 还原酶是生物体内蜡质合成的关键酶之一，在动物、植物和微生物中广泛存在。截至目前，蜡质合成途径以及关键酶的研究较少，仅有少部分植物(拟南芥和希蒙德木等)[24]、动物(小鼠和鹅等)[25-26]和昆虫(褐飞虱和巢蛾等)[27-29]开展了FAR 的功能研究。随着研究工作的深入展开，发现far基因在昆虫基因组中一般以基因家族存在，如对褐飞虱far基因家族进行了功能分析[30]。本研究基于白蜡虫的全基因组数据，结合生物信息学分析方法对其far基因家族进行鉴定，获得30 个far候选基因，多数含有NADB_Rossmann 结构域和FAR C 结构域；氨基酸普遍等电点大多在7 以上，说明其可能多在弱碱性环境发挥作用。

基因家族成员可以紧密排列在一起，形成1 个基因簇(一般认为200 kb 的核苷酸单位中含有3 个以上基因的基因群)[31]，更多的家族基因分布在同一染色体的不同部位，或者分散于不同的染色体，具有各自不同的表达调控模式。对白蜡虫far基因的染色体分布和基因重复进行分析后发现2 个基因簇，其中的11 对基因有一定的共线性。白蜡虫far基因家族仅有2 个基因簇，其他基因大多存在于不同contig 上。这些成簇排列的far基因可能由基因复制产生，具有共线性的far基因可能有相同的起源。基序在白蜡虫far基因家族成员内分布相似，在白蜡虫FAR 的NJ 树中，含有基序11 的聚为一小支，表明含有相同基序的FAR 序列或者功能可能更相似。

不同物种的FAR 氨基酸相似性分析表明：多数相似性高的FAR 都是同一物种或亲缘关系近的物种。同属泌蜡功能相关的FAR 在相同物种间相似性高，在不同物种间相似性低。不同物种的FAR 进化分析表明：同物种的FAR 大多聚在一起，亲缘关系近的聚为1 小支。系统进化的分析结果与共线性分析的结果一致，从共线性分析来看，白蜡虫与亲缘关系最近的扶桑绵粉蚧的far基因有更多的共线性连线，而与拟南芥的far基因共线性连线非常少。

4 结论

本研究获得30 个白蜡虫far基因候选基因，其中22 个具有完整的结构域。序列分析和系统进化分析表明：这些基因存在很多保守基序，基因之间共11 个共线性模块，聚类为2 大支，不同物种之间的FAR 亲缘关系较远。该研究为了解白蜡虫far基因的功能分化提供了参考。