肿瘤抗体药物偶联物的研发进展和挑战*

李博乐 冯红蕾 魏枫 孟帅 吴春暖 张洁 任秀宝

抗体药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）是新一代的以大分子为载体的靶向药物，由抗体和小分子细胞毒药物（载荷毒素）通过连接子形成偶联物，利用抗体的靶向性，特异性识别靶细胞表面的抗原，经由网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，通过裂解或酶解的方式，释放细胞毒药物，达到杀伤靶细胞的目的（图1）。其独特的构成方式，使其药物设计、药代动力学、药效学、疗效、不良反应甚至耐药机制均不同于其他类型的药物。Adcetris®和Kadcyla®等ADC 药物相继取得成功，显示了此类药物在抗肿瘤治疗领域的巨大潜力，并引起了广泛关注。截至2022年2月，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准12 款ADC 药物上市，全球共有14 款ADC 药物上市（表1）；同时，超过80 款ADC 药物正在开展临床试验，适应证也拓展到更多的疾病领域[1]。

表1 全球已上市ADC 药物概览

表1 全球已上市ADC 药物概览 （续表1）

ADC 药物自发展之初，经历了三代技术变革，第一代ADC 使用鼠源单抗，存在免疫原性反应，载荷毒素活性较差，连接稳定性差，导致治疗窗窄，安全性低；第二代ADC 采用人源化单抗，免疫原性降低，且靶向性和连接稳定性均有所提高；第三代ADC 在偶联方式上有所改进，由随机偶联改为定点偶联，并采用计量载荷毒素技术，使药物-抗体偶联比（drug-to-antibody ratio，DAR）的分布集中，增强疗效的同时降低不良反应，改善了药代动力学特性[2]。本文就ADC 药物的靶点、抗体、载荷毒素、连接子及偶联方式的进展进行综述。

1 靶标抗原的选择

靶细胞的识别和内吞是ADC 药物发挥作用的基础，一个有效的靶标抗原是将载荷毒素成功递送进入目标细胞的关键驱动因素。随着更多靶标抗原的发现，一些适于ADC 药物靶点的关键特性如下：1）靶标抗原需要有特定的表达谱，即在药物的作用部位（通常是肿瘤细胞）高表达，而在正常组织中低表达或不表达。2）靶点的内化和周转率，控制着载荷毒素输送至生物层的效率，影响药物的活性。非内化或内化效率低使未内吞的药物引发毒性，因此提高细胞的穿透效率对靶抗原的选择很重要。3）靶标抗原的密度（受体拷贝数）同样重要，从单抗与靶标抗原结合的机制出发，对于内化速率低的靶标抗原而言，载荷毒素的递送效率对靶点密度更敏感[3]。

近年来也发展出一些多样化的筛选方法，如基于mRNA 表达数据库、TCGA 数据库等分析ADC 药物靶标的表达谱，但因mRNA 的局限，如未翻译成蛋白质、产生的蛋白质不呈现在细胞表面、不能内化等因素，须谨慎解释 mRNA 表达数据。也有报道利用基因组学和蛋白组学的方法候选mRNA 分析中掩盖的靶标抗原从而发现潜在靶点。目前已上市的ADC 药物针对血液肿瘤的靶点有CD19、CD22、CD30、BCMA等，针对实体瘤的靶点有HER2、TROP2、Nectin4、EGFR 和HF。实体瘤的抗原表达存在不稳定的问题，抗原缺失会造成耐药问题，因此，除肿瘤细胞表达的抗原外，利用肿瘤微环境或肿瘤干细胞表达的抗原也已进入临床阶段，如CD25、CD205、B7-H3、DLL3、PTK7、5T4 等[4]，这些基因组产生突变的可能性更低，并能在肿瘤微环境中的特殊环境下响应断裂，释放药物至肿瘤细胞外的基质，从此方向解决耐药性问题。

2 抗体的选择

抗体的选择应满足低免疫原性，低交叉反应活性，高靶点结合能力和在血浆中适宜的半衰期。

IgG 是目前已上市和在研ADC 药物主要的抗体骨架。人类IgG 包含4 个亚型，分别为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，四者在恒定结构域和铰链区有所不同，导致其与补体及Fcγ 受体的亲和力及半衰期不同。因IgG1 亚型有丰度较高，较好地平衡免疫激活效应和半衰期的关系，更易开发，大多数ADC 药物采用该亚型；IgG2 由不同的二硫异构体结构连接成复杂的铰链区；IgG3 由于清除率过快而不被采用；而IgG4 因铰链区的丝氨酸-脯氨酸突变可能形成半抗体或双特异性抗体而造成脱靶效应，目前多采用S228P 点突变来克服此缺陷。IgG2 和IgG4 与补体及Fcγ 受体的亲和力稍弱，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和补体依赖的细胞毒作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）效应相对较弱。研发过程中，为了提高药物的效力或降低ADCC，CDC 效应叠加载荷毒素带来的不良反应，而采用不同的IgG 亚型；或在相同亚型上进行去岩藻糖修饰或氨基酸突变等[5]。如曲妥珠单抗-美坦新偶联物保留了曲妥珠单抗本身的特征，与HER2 结合并抑制PI3K-AKT 通路，发挥Fcγ 受体介导的ADCC 效应以增强药物效力。而靶向CXCR4的先导ADC 713，为了减轻对造血干细胞和祖细胞的毒性，通过Fc 段N297A 的突变降低了ADCC 和CDC 效应，以实现低毒高效的目的[6]。

随着抗体工程的发展，近年来出现了为增加抗原亲和力及克服肿瘤异质性而采用的双特异性抗体药物偶联物[7]；此外，抗体作为大分子，限制了其向肿瘤组织的递送和渗透能力，为了提高渗透能力而采用的抗体片段药物偶联物[8]，多肽偶联药物，以及小分子配体偶联药物均成为目前研究的热点。

3 载荷毒素的选择

小分子细胞毒药物作为ADC 药物发挥杀伤肿瘤的主要组成部分，其毒性和理化特性会直接影响疗效，其选择需要考虑以下方面：1）具有较高的抗肿瘤活性，IC50范围通常在10−10～10−12M[9]。毒素偶联至抗体后仍保持稳定性和细胞毒活性，传统的化疗药如甲氨蝶呤、长春花碱等，偶联后细胞毒作用大幅降低，无法发挥杀伤能力。2）具有适当的亲水性，确保偶联物在生理条件下有较好的溶解度。疏水性过高，尤其是叠加DAR 值高的因素后，易诱发抗体聚集，引起药物清除率和免疫原性增加，从而降低药效。3）有适当的官能团，便于与连接子进行偶联[10]。

目前已上市的ADC 药物的载荷毒素主要有两大类型，一类是微管蛋白抑制剂，另一类是DNA 破坏剂，见图2。

3.1 微管蛋白抑制剂

微管对细胞的形态维持，细胞运动、分裂，胞内物质转运和信号转导均起着重要的作用。因其动态不稳定性，微管蛋白抑制剂可分为微管蛋白聚合抑制剂和促进微管蛋白聚合的稳定剂，代表药物分别是长春碱类和紫杉烷类，已上市的ADC 载荷毒素多属于前者。dolastatins-10 是海洋软体动物Dolabellaauricularia的一种多肽，以其结构为基础合成的单甲基auristatin E（MMAE）和单甲基auristatin F（MMAF），细胞毒性是长春碱的200 倍；MMAE 和MMAF 也是在研临床试验中采用最多的载荷毒素。Maytansine（美登素）从Maytenus 属植物分离而得，经过半合成得到maytansinoids（美登素类化合物）如DM1、DM3、DM4，其细胞毒性是长春新碱的100 倍，三者的区别在于侧链不同带来的稳定性差异和连接方式的可选择性。Tubulysins 分离自粘细菌培养物，IC50值为0.01～10 nM，其细胞毒性是紫杉醇的1 000 倍，但本身水溶性差，通过连接β-环糊精和聚乙二醇及纳米颗粒的封装，大幅提高了其水溶性和效力[11]。Cryptophycins（念珠藻素）从陆地蓝绿藻分离而来，因稳定性和水溶性差，在体内无活性，经结构改造得到的cryptophycin 52 在皮摩尔浓度水平有抗肿瘤活性[12]。

3.2 DNA 破坏剂

DNA 破坏剂较微管蛋白抑制剂有更高的效力，其IC50值范围通常在皮摩尔浓度水平，不依赖细胞周期，对非分裂细胞的杀伤更显优势。目前研发的载荷毒素DNA 破坏剂有四种作用机制[13]：1） DNA 双链断裂，代表药物为calicheamicin（卡奇霉素），由Micromonospora echinospora 细菌分离得到，calicheamicin γ1 效力较高，其细胞毒性约为多柔比星的4 000 倍。2）DNA 烷基化，代表药物duocarmycin（倍癌霉素），由Streptomyces zelensis 链霉菌分离得到，可与DNA 小沟结合，引起不可逆的烷基化。3）DNA嵌入，代表药物为喜树碱类似物，即拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，如Exatecan mesylate（DX-8951f），经过氨基羟基乙酰化得到DS8201 的载荷部分），对MDR1 介导的耐药细胞有效；再如SN-38，伊利替康的活性代谢物，比母体效力高约1 000 倍。4）DNA 交联，代表药物为吡咯并苯二氮䓬类化合物（pyrrolobenzodiazepines，PBD），可识别并交联到DNA 小沟的特定序列，选择性烷基化形成惰性的共价化合物。Anthramycin（安曲霉素）是第一个合成的PBD 化合物，目前已有超过10 个PBD 类似物在研。PBD 的二聚体使其体外效力提升了600 倍，此外，PBD 可以避免MDR1 介导的耐药性[14]。

3.3 新型载荷毒素

除了上述两类上市ADC 药物采用的载荷毒素类型，近年来又发展出多种类型的载荷毒素，包括凋亡诱导剂（Bcl-xl 抑制剂）、RNA 剪接抑制剂、转录抑制剂、蛋白酶抑制剂[15]等。此外，将疾病相关信号通路的药物作为载荷毒素，也将ADC 药物拓展至肿瘤外的其他领域。

4 连接子的选择

连接子是建立抗体与载荷毒素共价连接的部分，不仅关系到药物的稳定性，还影响其药代动力学、药效学和治疗窗。连接子应具有适当的稳定性，避免到达靶点前裂解而产生脱靶毒性；并能在作用位点快速裂解或酶解，释放载荷毒素；同时还需保持适当的亲水性，疏水性连接子偶联疏水性载荷毒素促进ADC 药物聚化，增加了MDR1 的外排和药物清除，降低了药物的效力。

为了增强连接子和载荷毒素连接的稳定性，近年来发展出一些新的连接策略，如组织蛋白酶特异性识别的肽键、糖苷酶可裂解的糖苷键、磷酸酶可裂解的磷酸二酯键等，利用这些化学触发器，增强了裂解特异性的同时增加了药物在血浆中的稳定性。如利用含有β-半乳糖苷键的邻羟基保护的芳基硫酸盐连接子，在PBS 和血浆中均表现出7 天的稳定性[16]。此外，简化连接子结构以降低临床前研究难度也是改进策略，如通过二硫键将载荷毒素与抗体上的工程化氨基酸直接相连，实现药物在血液循环中的稳定性[17]。

连接子从载荷毒素的释放机制上可分为可裂解连接子和不可裂解连接子（图3）；从连接方法上分为化学依赖的连接和酶依赖的连接。

4.1 可裂解的连接子

4.1.1 pH 敏感的腙键 设计的初衷是偶联物在胞内核内体（pH 5.0～6.0）或溶酶体（pH 约4.8）进行降解，但实际情况是药物在血液循环（pH 7.4）中也存在不稳定的情况，易裂解而造成脱靶毒性。如辉瑞公司的Mylotarg®2010年自主退市，正是因为其初始剂量设置过高加上连接子不稳定造成的严重肝脏毒性[18]。目前，该类型连接子构成的ADC 药物主要应用局限于血液肿瘤。

4.1.2 可还原的二硫键 l 在生理pH 条件下稳定，但容易受到硫醇的亲核攻击。肿瘤胞质中含大量的谷胱甘肽（1～10 mM），含有硫醇基团。因此，利用肿瘤细胞内外谷胱甘肽的浓度差，尤其是肿瘤细胞的氧化应激会提高胞内GSH 水平，实现裂解释放载荷毒素。在二硫键旁插入甲基进一步增强此类连接子在血液循环中的稳定性。辉瑞公司的Mylotarg®和Besponsa®均采用此技术；另外，美登素类化合物因其酰胺键的β 位含有硫醇基团，而便于采用此种策略进行偶联[19]。

4.1.3 组织蛋白酶B 特异性识别的二肽或多肽键组织蛋白酶B 在多种肿瘤细胞中过表达，该酶有很多底物，但优先识别苯丙氨酸-赖氨酸（Phe-Lys）和缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）等序列，并裂解C-末端的肽键。Phe 和Val 作为疏水残基，保持了在血浆中的稳定性，而Lys 和Cit 作为亲水残基，保证了水溶性并降低了药物的聚集性。为了使载荷结构和单抗结构间利于酶的进入，引入一个无活性的间隔单元对氨基苄氧羰基（PABC），上述序列连接PABC 构成Val-Cit-PABC和Val-Ala-PABC 连接子[20]。代表药物有美国Seagen公司的Adcetris®和Padcev®。值得注意的是，尽管该类型连接子较腙键和酯键有更好的稳定性，但Phe-Lys 的长期稳定性仍待提高。此外，不同序列的亲疏水性不同，稳定性不同，可实现的的药物DAR 值也有所区别。

4.1.4 糖苷酶可裂解的糖苷键 β-葡萄糖醛酸酶是一种糖苷酶，可水解多糖中的β-葡萄糖醛酸残基，专属性强；在肿瘤细胞和肿瘤间质均有分布，理论上提供了ADC 药物在肿瘤微环境中发挥作用的可能性。结构上采用β-葡萄糖醛酸单元连接间隔单元构成连接子。该连接子的亲水性使构成的ADC 药物不易聚化，从而降低了药物清除率而提高效力，且能负载更多的载荷毒素提高DAR 值，进一步提高药物效力[21]。

4.1.5 （焦）磷酸酶可裂解的（焦）磷酸二酯键 该类酶在溶酶体中选择性表达，结构是一种阴离子连接子，具有更好的亲水性和稳定性。偶联物内化后，通过内体-溶酶体的（焦）磷酸酶进行两步酶切，裂解得到醇类化合物。释放载荷药物的速率取决于靠近（焦）磷酸结构的取代基，通过引入乙缩醛间隔单元加速药物释放[22]。但该类型连接子血浆稳定性稍差，需进行进一步修饰，如引入芳烃硫酸盐[23]。

4.2 不可裂解的连接子

连接子部分不被裂解或酶解，药物内化后依赖胞质或溶酶体对抗体部分的氨基酸进行酶解，释放出与氨基酸残基相连的载荷毒素。优点在于该类型连接子的ADC 药物在血液循环中更稳定，缺点在于裂解的载荷结构连有带电的氨基酸，影响其细胞的渗透性和活性[24]。采用这种类型连接子的ADC 药物不具有“旁观者效应”，即带电荷的载荷毒素无法进行跨膜转运，无法实现对靶抗原异质性表达的肿瘤细胞及肿瘤间质进行杀伤。因此，裂解后的载荷毒素须保持相当的抗肿瘤效力，这对载荷药物结构的选择和修饰提出了更高的要求。代表药物有罗氏公司的Kadcyla®和GSK公司的Blenrep®。

因此，连接子的选择要兼顾载荷毒素的结构和理化性质，使之利于连接并降低药物的聚集；平衡亲疏水性，保持稳定性和释放效率。此外，酶依赖的连接子残基单元在不同细胞或组织中的表达高低有别，可利用在肿瘤微环境中高表达的残基设计连接子以进一步提高药物效力。

5 偶联方式的选择

偶联方式可分为随机偶联和定点偶联。偶联方式不仅会影响DAR，还会影响ADC 药物的均一性。已上市的ADC 药物大部分采用随机偶联的方式，将不同数量的载荷毒素连接至抗体的不同位点，组成不同DAR 的异构混合物。DAR 过高会导致药物聚集，增加清除率，并可能因药物在血液循环中释放载荷毒素而造成不良反应。DAR 分布宽的ADC 混合物因药代动力学、活性、安全性各不相同，导致稳定性、疗效、生产的可重复性下降。定点偶联技术可以决定载荷毒素结合的位点和数量，尽管尚未做到DAR 值单一，但使DAR 值分布集中，降低异质性水平，提高ADC 药物的稳定性，改善了药动学特性，使之更易预测。目前，对不同性质的载荷毒素及抗体类型，选择何种位点特异性的修饰方法最优，尚难以预测。但随着新型分析技术的应用，以及ADC 药物临床前及临床数据的积累，将会发展出定点偶联的选择策略。

5.1 随机偶联

随机偶联产生的ADC 药物DAR 值主要受药物/抗体化学计量比的控制。

5.1.1 赖氨酸偶联 此种偶联方式可靠、高产，抗体上约有80 个赖氨酸残基，具有高丰度的特点，其中有10 个可供连接[25]。缺点是偶联后会得到连接在不同位点的不同DAR 值的产物，且有些赖氨酸残基接近抗体的互补决定区，会影响抗体的特异性和亲和力。DAR 的控制主要依靠载荷药物/抗体的化学计量比。代表药物有罗氏公司的Kadcyla®，辉瑞公司的Mylotarg®和Besponsa®。

5.1.2 半胱氨酸偶联 人IgG1 抗体有4 个链间二硫键和12 个链内二硫键，链间二硫键不影响抗体稳定性，与马来酰亚胺的连接子反应，产生DAR 值为2、4、6、8 的ADC 药物[25]。由于结合位点数量有限和巯基的独特反应性，用半胱氨酸作为连接位点有助于控制DAR，降低异质性。代表药物有Seagen 公司的Adcetris®。

5.2 定点偶联

5.2.1 对天然抗体的位点特异性修饰 在不改变抗体结构的基础上，利用不同方法对抗体的不同位点进行修饰：1）化学法修饰氨基酸：利用可逆分子间反应将“化学关键蛋白”置于抗体的赖氨酸残基，其官能团与赖氨酸残基上可逆地形成亚胺，从而实现标记蛋白的目的。然后，关键蛋白通过试剂中的环氧化物与近端组氨酸残基反应以调节位点的选择性。最后通过酰胺键与连接子及载荷药物偶联[26]。Matos 等[27]采用烯酸磺酰试剂可控地修饰蛋白质中最亲核（pKa 最低）的赖氨酸残基，即选择性地修饰单一赖氨酸残基，大幅降低异质性。也有多项报道利用自降解的马来酰亚胺，即通过邻近的官能团，如伯胺、聚乙二醇、N-芳烃催化马来酰亚胺开环，以实现与半胱氨酸选择性的反应[28]。2）二硫键桥连：ThioBridge®技术利用双砜烷基化抗体链间还原型二硫键的巯基基团，从而以共价方式重新连接二硫键并和连接子偶联，根据连接子上载荷药物的数量，可形成DAR 4、8、16 的偶联物，所得的偶联物保留了与抗原的亲和力，并在血液中稳定[29]。成熟的交联试剂除双砜外，还有新型马来酰亚胺和哒嗪类化合物。该技术的优点是反应动力学和产物均质性好，糖基化模式不受影响；缺点是可能形成链间错位桥连。3） 糖基化修饰 IgG 的Fc 片段重链的CH2 结构域N297 位置包含1 个N-聚糖，因与可变区抗原结合位点相距较远，其修饰几乎不影响抗体的抗原结合能力；加上不同抗体类型的糖基化模式保守，简化了修饰难度，是一个很好的位点特异性修饰连接点[30]。具体的方法为：①糖氧化，氧化聚糖为醛，与酰肼修饰的连接子进行偶联；为了降低异质性，将对氧化剂（如高碘酸盐）敏感的唾液酸残基引入抗体N-聚糖，降低氧化剂的浓度，并使氧化只针对该残基。②内切糖苷酶，催化水解非末端糖残基间的多糖链，水解后，糖基被连接到新的末端残基上，从而功能化糖链的核心结构，以便连接子的偶联。③糖基转移酶，对抗体进行修剪，去除特定的糖残基，然后通过酶催化，产生叠氮化物或酮的标记，以便连接子偶联。该技术的优点是产物均质化，不改变氨基酸序列；缺点是糖基化特征在免疫识别中起重要作用，修饰的同时要避免影响。

5.2.2 工程化抗体的位点特异性修饰 利用不同的方法在抗体结构上引入天然或非天然的氨基酸：1）化学法引入工程化氨基酸 THIOMAB™技术在抗体两个重链上引入新的半胱氨酸残基，经部分还原暴露反应性的硫醇，用于连接子偶联。经过改造的半胱氨酸技术能够稳定生成DAR 为2 的高度同质ADC（占比高达92.1%）。在此基础上，新方法不断提升DAR，包括通过将半胱氨酸残基进行硫醇芳基化和使用二溴重新桥接二硫键，这两种方法将得到DAR 值分别为4.4 和4 的ADC[31]。在抗体的不同位置工程化半胱氨酸改造，产物的抗原结合、内源稳定性和效力不同，具有低溶剂可及性和局部正电荷的半胱氨酸残基在血浆中更稳定。该技术的优点是产物均质化，通过修饰可调反应性和稳定性；缺点是需进行基因工程。2）酶法插入工程化氨基酸：采用特定的酶，识别特定的氨基酸序列，经修饰暴露出反应基团，与相应的连接子进行偶联。如SMARTag 技术，创建了特定氨基酸序列标签Cys-X-Pro-X-Arg，利用甲酰甘氨酸生成酶（FGE）识别其中的半胱氨酸，并氧化位甲酰甘氨酸，修饰后的抗体可与醛基特异性的连接子进行偶联[32]。再如利用微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG），催化去糖基化抗体的295位谷氨酰胺侧链与伯胺之间形成共价键。单抗的重链Fc 段均含有谷氨酰胺残基，只要酰基受体含有伯胺，就可以进行偶联，并产生均一的DAR 值为2 的偶联物[33]。该技术的优点是酶法反应条件温和，特异性高，产物均质化，可改变DAR；缺点是需进行基因工程。3）引入非天然氨基酸：利用定位突变方法在克隆基因上产生1 个终止密码，由tRNA/氨酰tRNA 合成酶在转录mRNA 上识别，再经肽酰转移酶及延伸因子的催化将非天然氨基酸（ncAA）引入肽链的特定位置。从而使非天然氨基酸整合到抗体序列中，形成定点修饰。引入的位置要远离抗原结合区，铰链区以及已知对Fc 受体重要的残基，位点可暴露于溶剂且易于偶联。引入的ncAA 不能引起免疫原性，能充分进行共轭反应，目前成熟的有酮类、叠氮类、环丙烯类或二烯类官能团[34]。如通过在抗体中引入β-乙酰苯丙氨酸（pAcPhe），含有天然氨基酸中没有的酮，酮官能团与烷氧基胺间可形成肟键，该键在生理条件下非常稳定[35]。该技术的优点是产物均质化，通过修饰可调反应性和稳定性；缺点是需进行基因工程。

6 结语

ADC 药物的作用机制独特，经过三代技术的发展，其稳定性，DAR 值均一性和抗肿瘤活性均得到提升，治疗窗也得以拓宽，对其作用机制的深入理解使其在抗原选择、抗体修饰、载荷药物筛选、连接子的构建和偶联方式的改进及工艺标准的提高上均有突破，这使更多的ADC 药物能够上市，并让患者获益。但同时也应注意，ADC 药物的已知架构与临床获益、不良反应及耐药间的联系仍需进行探索。目前，多个候选药物和ADC 创新疗法处于研究阶段，该类药物在肿瘤微环境中的影响也在探索中，其安全和广泛使用还需要进行药效学和安全性生物标志物的研究。随着临床试验的深入，仅适用于化疗药物或抗体药物的研究方法可能无法预测ADC 药物的临床表现，因此还需开展一系列的临床和基础研究解决各种问题。

此外，ADC 药物构成元素多样，使其技术平台的应用潜力巨大：1）替换抗体部分可以构成多肽偶联药物，核酸适体偶联药物等，而替换载荷细胞毒药物部分可以构成抗体免疫刺激偶联药物，抗体寡核苷酸偶联药物等。2）该类药物及技术平台针对的疾病不局限于肿瘤，通过拓展至抗体+抗菌药，抗体+Toll 样受体激动剂等，已形成多样化的药物创新模式。