气相色谱技术测定棉籽及其饼(粕)中环丙烯脂肪酸含量

贾怡文，陈小威，孙尚德，毕艳兰，崔胜成

(1.河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001； 2.新疆泰昆集团股份有限公司，新疆 昌吉 831100)

我国饲料资源尤其蛋白饲料资源短缺，棉籽作为大豆以外的第二大优质蛋白质资源，对其开发利用具有重要意义。然而，棉籽及其饼(粕)在饲料上的利用率却不到30%，最主要的原因在于棉籽饼(粕)中存在棉酚、环丙烯脂肪酸(Cyclopropene fatty acids，CPFAs)抗营养因子，致使棉籽饼(粕)在饲料行业中利用受限[1-3]。环丙烯脂肪酸是棉酚之外影响棉籽及其饼(粕)利用的第二大抗营养因子，影响鸡、鱼及一些单胃动物的代谢[4-6]。棉籽中含有苹婆酸和锦葵酸两种CPFAs，其中苹婆酸毒性较大，会诱导蛋白质变性，影响糖代谢，导致母鸡产蛋率下降以及牛肉肉质硬化等[7-9]。

棉籽及其饼(粕)中 CPFAs测定分析对其在饲料中的应用和脱除研究具有重要意义。相较于传统Halphen实验的定性分析，利用色谱技术进行量化分析CPFAs可指导饲料配方中的添加量。通过苯甲酰衍生化处理后利用双柱反相高效液相色谱对棉籽油中的CPFAs进行分离，再结合外标法可实现定量分析，但存在步骤烦琐、成本高等缺陷[10]。王美霞等[11]通过全自动索氏浸提装置提取棉籽油，采用气相色谱质谱联用技术将棉籽油中脂肪酸成功分离，并证实肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、锦葵酸、亚油酸、苹婆酸、二氢苹婆酸和花生酸是棉籽油的特征脂肪酸，但CPFAs与普通脂肪酸的分离效果不佳。目前脂肪酸含量测定的国标方法有GB/T 21514—2008《饲料中脂肪酸含量的测定》和GB 5009.168—2016《食品安全国标标准 食品中脂肪酸的测定》，二者均采用气相色谱法，但棉籽油脂肪酸的多样性和CPFAs分子中环丙烯结构的敏感性使其与普通直链脂肪酸的分析检测在脂肪酸衍生化、色谱柱选择和色谱分离条件等方面存在显著差异[12-14]，从而造成国标方法均难以实现CPFAs的有效分离[15]。这影响了棉籽及其饼(粕)中CPFAs的量化分析，进而限制了为饲料配方中的应用提供直接信息。

基于此，本研究利用气相色谱法量化分析棉籽及其饼(粕)中CPFAs的含量，考察了不同脂肪酸衍生化方法、气相色谱条件，建立具有较好分离度的色谱操作条件，并进一步建立CPFAs的外标定量测定方法，实现对棉籽及其饼(粕)中CPFAs的准确量化分析，为棉籽及其饼(粕)在饲料中的应用提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 实验材料

棉籽、棉籽饼和棉籽粕，新疆泰昆集团股份有限公司提供。苹婆酸甲酯 (C20H36O2，纯度≥98%)、锦葵酸甲酯(C19H34O2，纯度≥95%)标准品，美国Matreya脂质与生物化学科技有限公司；37种脂肪酸甲酯标准品,美国Sigma公司。

Agilent 7890B气相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；RV 10 control auto V旋转蒸发仪，德国IKA科技有限公司；赛多利斯SQP电子天平；FS-100小型粉碎机，鹤壁市英泰电子电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 棉籽及其饼(粕)中油脂的提取

通过油脂提取方法的筛选，确定采用GB/T 6433—2006中的方法对棉籽及其饼(粕)中油脂进行提取。

1.2.2 棉籽油脂肪酸衍生化

(1)碱式甲酯化：准确称取棉籽油0.1 g，用正己烷定容于10 mL容量瓶内；用移液管准确移取3 mL样液于小瓶中，加入2 mL氢氧化钠-甲醇溶液，剧烈混匀7 min，静置待分层后，将上清液移至试管中，加入约1 g无水硫酸钠，取上清液经0.45 μm 滤膜过滤，所得滤液即为试样的待测液。

(2)简易碱式甲酯化：准确称取0.1 g棉籽油置于10 mL容量瓶内，用色谱级正己烷定容；用移液管准确移取3 mL样液于小瓶中，加入2 mL甲醇钠，剧烈混匀7 min，放置约1 min，混合溶液出现分层，将上清液移至试管中，加入约1 g无水硫酸钠，取上清液经0.45 μm 滤膜过滤，所得滤液为试样的待测液。

(3)三氟化硼甲酯化：准确称取0.1 g棉籽油置于10 mL容量瓶内，用色谱级正己烷定容；用移液管准确移取3 mL样液于25 mL烧瓶中，加入沸石，用移液管移取7 mL甲醇溶液于烧瓶中。连接回流装置，回流过程中不断搅动烧瓶，煮沸并计时7 min，至溶液变透明。从冷凝管上端用移液管加入7 mL三氟化硼-甲醇溶液，继续回流1 min，再加入2.4 mL正己烷回流1 min，最后撤掉热源，取出烧瓶，加入氯化钠饱和溶液至烧瓶的颈部，静置分层30 min，将上清液移至试管内，加入约1 g无水硫酸钠，取上清液经0.45 μm 滤膜过滤，所得滤液为试样的待测液。

(4)硫酸催化甲酯化：准确称取0.1 g棉籽油置于10 mL容量瓶内，用色谱级正己烷定容；用移液管准确移取3 mL样液于20 mL具塞试管中，加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液混匀，置于70℃水浴加热60 min，冷却后加入饱和氯化钠溶液至溶液分层，将上清液放至试管内，加入约1 g无水硫酸氢钠，取上清液经 0.45 μm滤膜过滤，所得滤液为试样的待测液。

1.2.3 环丙烯脂肪酸含量的测定

1.2.3.1 标准曲线建立

准确称取苹婆酸甲酯25 mg和锦葵酸甲酯5 mg于10 mL容量瓶中，用色谱级正己烷溶解并定容，摇匀，得到质量浓度分别为2.5 mg/mL和0.5 mg/mL标准储备溶液，于-18℃下保存备用。临用前分别取标准储备溶液稀释成系列标准溶液进行气相色谱(GC)分析，建立标准曲线。

1.2.3.2 GC分析条件

配有氢火焰离子化检测器的气相色谱仪，进样口与检测器温度均为280℃，载气为高纯氮气(99.999%)，分流比为1∶20；初始柱温为100℃, 以一定的速率升至220℃；进样量为1 μL。

1.2.3.3 定量分析

相对含量测定：采用峰面积归一化法，根据锦葵酸或苹婆酸甲酯相应峰面积对所有脂肪酸甲酯峰面积总和的占比来计算锦葵酸和苹婆酸的含量。

绝对含量测定：采用外标法，通过锦葵酸或苹婆酸甲酯标准品的标准曲线方程，分别将其峰面积代入方程，并根据甲酯与相应脂肪酸的换算系数计算脂肪酸绝对含量。

2 结果与分析

2.1 气相色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

鉴于色谱柱对脂肪酸分离效果的影响，固定升温速率(2.0 ℃/min)和氮气流速(0.6 mL/min)下，考察了常见的3种色谱柱SGE BPX-70色谱柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm)、HP-88色谱柱(0.25 mm×0.25 μm×100 m)、DB-1ht毛细管柱(28.0 m×250 μm× 0.1 μm)对棉籽油脂肪酸(衍生化方法采用1.2.2中简易碱式甲酯化)的分离效果，如图1所示。

图1 不同色谱柱对棉籽油脂肪酸的分离效果

由图1a可以看出，以中等极性填料的SGE BPX-70色谱柱分离时，脂肪酸没有得到很好的分离。HP-88色谱柱是填料为氰丙基芳基聚硅氧烷的毛细管柱，具有强极性。由图1b可知，虽然HP-88色谱柱柱长有100 m，但是棉籽油脂肪酸在60 min内仍未得到有效分离，12 min时出现溶剂峰，57 min时出现棕榈酸峰，不利于脂肪酸的检测。DB-1ht毛细管柱为非极性高温柱，耐受温度达400℃。从图1c可知，DB-1ht 毛细管柱对棉籽油脂肪酸具有良好的分离效果。

综上，选取DB-1ht非极性毛细管柱作为环丙烯脂肪酸的分离柱。

在采用标准品确认锦葵酸(MLV)和苹婆酸(STC)出峰位置的基础上，利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对环丙烯脂肪酸进行进一步实证。GC-MS条件：DB-SMS毛细管色谱柱(60 m×0.32 mm×1 μm)，离子源温度230℃，EI源离子化方式，四极杆温度150℃，全扫描模式，质量扫描范围 (m/z)40～500，溶剂延迟时间3 min。结果见图2。

图2 棉籽油中锦葵酸、苹婆酸和二氢苹婆酸的GC-MS离子峰谱图

从图2可知，锦葵酸(图2a)和苹婆酸(图2b)及另一种环丙烷脂肪酸，即二氢苹婆酸(图2c)[16]被证实存在于棉籽中。

2.1.2 程序升温速率对分离效率的影响

采用DB-1ht非极性毛细管柱作为分离柱，在0.6 mL/min氮气流速下考察了程序升温速率对棉籽油脂肪酸分离的影响，结果如图3所示。

图3 程序升温速率对棉籽油脂肪酸中锦葵酸(MLV)和苹婆酸(STC)分离效果的影响

从图3a可知，在3.0℃/min升温速率下45 min内完整分离出全部脂肪酸，锦葵酸和苹婆酸分别出现在31.0 min和33.8 min，但油酸和亚油酸没能被很好地分离。出现这种现象的原因是升温速率太快，不利于脂肪酸的分离。从图3b可知，在 2.0 ℃/min升温速率下，在60 min内脂肪酸可以被很好地分离，锦葵酸和苹婆酸分别出现在41.6 min和45.8 min。苹婆酸和锦葵酸的出峰时间相差大，同时其他脂肪酸也得到良好的分离，有利于进行定量分析。从图3c可知，1.5 ℃/min升温速率下，在60 min内并未呈现出完整的分离峰，锦葵酸峰出现在51.2 min，而60 min内并未出现苹婆酸的峰。综上所述，选择最佳升温速度为2.0 ℃/min。

2.1.3 氮气流速对分离效率的影响

采用DB-1ht非极性毛细管柱作为分离柱，在恒定升温速度2.0℃/min下考察了氮气流速对棉籽油脂肪酸的分离效果，结果如图4所示。

图4 氮气流速对棉籽油脂肪酸中锦葵酸(MLV)和苹婆酸(STC)分离效果的影响

从图4可知：当氮气流速为1.0 mL/min时，锦葵酸和苹婆酸的出峰时间分别为37.4 min和41.6 min；当氮气流速为0.6 mL/min时，锦葵酸和苹婆酸色谱峰分别出现在41.6 min和45.8 min；而在氮气流速为0.4 mL/min时，在45.5 min和49.7 min分别出现锦葵酸和苹婆酸。可见，随着氮气流速的降低，脂肪酸分离图中锦葵酸和苹婆酸色谱峰的出现时间向右移动。为了实现在适当时间内得到较好的脂肪酸分离效果，氮气流速选择0.6 mL/min。

2.2 衍生化方法对环丙烯脂肪酸分析的影响

为了准确测定环丙烯脂肪酸的含量，在优化的色谱条件基础上对4种衍生化方法(碱式甲酯化、简易碱式甲酯化、三氟化硼甲酯化、硫酸催化甲酯化)进行了系统比较。相同质量的棉籽油经过不同衍生化后所得的GC图谱如图5所示。

图5 4种不同甲酯化条件下的棉籽油脂肪酸GC图谱

从图5可知，在碱式甲酯化、简易碱式甲酯化和三氟化硼甲酯化后的GC图谱中均观察到锦葵酸和苹婆酸。然而，硫酸催化甲酯化后的GC图谱中没有观察到锦葵酸和苹婆酸的峰，且其他脂肪酸的峰值也较低。

不同衍生化方法对锦葵酸和苹婆酸的出峰面积和相对含量的影响如表1所示。从表1可知：碱式甲酯化所得的锦葵酸峰面积为76.69，脂肪酸相对含量为0.75%，苹婆酸峰面积为40.51，相对含量为0.39%；简易碱式甲酯化后的锦葵酸峰面积为43.75，相对含量为0.72%，苹婆酸峰面积为21.87，相对含量为0.36%；三氟化硼甲酯化所得的锦葵酸峰面积为34.07，相对含量为0.68%，苹婆酸峰面积为17.08，相对含量为 0.34%。4种处理方法得到的锦葵酸和苹婆酸峰面积大小均为碱式甲酯化>简易碱式甲酯化>三氟化硼甲酯化>硫酸催化甲酯化，可知碱式甲酯化的衍生化效果最好，这与文献[10，17-18]报道一致。因此，选择碱式甲酯化方法进行衍生化。

表1 不同衍生化方法对棉籽油中锦葵酸和苹婆酸峰面积及相对含量的影响

通过对棉籽油进行碱式甲酯化后的色谱分析并结合GC-MS分析棉籽油主要脂肪酸组成及含量，结果如表2所示。

表2 棉籽油脂肪酸组成及相对含量

由表2可知，棉籽油共检出13种脂肪酸，以亚油酸(55.446%)、棕榈酸(22.476%)、油酸(15.229%)和硬脂酸(2.084%)为主，还含有顺式异油酸(0.824%)、肉豆蔻酸(0.691%)、棕榈油酸(0.506%)、十七烯酸(0.074%)、十七酸(0.088%)、花生酸(0.270%)、锦葵酸(0.720%)、苹婆酸(0.370%)和二氢苹婆酸(0.308%)。

2.3 GC测定环丙烯脂肪酸的方法学评价

2.3.1 重复性评价

在优化的色谱条件下，按1.2.3方法利用标准品建立锦葵酸甲酯(Y=1.646X-1.063，R2= 0.997，线性范围1～250 μg/mL)和苹婆酸甲酯(Y=1.333X-2.499，R2= 0.998，线性范围5～1 250 μg/mL)的线性回归方程。利用线性回归方程对棉籽中的CPFAs含量进行了分析。表3为GC测定棉籽中CPFAs的重复性评价分析结果，重复过程包括棉籽油的提取、衍生化和GC分析得到两种CPFAs的含量。从表3可知:提油率平均值为28.19%，RSD为2.63%(<5%)，重复性良好；外标法测定的锦葵酸和苹婆酸平均含量以及RSD分别为2.73 mg/g、1.32%(< 5%)和1.07 mg/g、2.13%(<5%)。由此可知，衍生化和GC分析过程也具有良好重复性。综上可知，所建立的GC测定CPFAs含量的方法重复性良好。

表3 GC测定棉籽中CPFAs的重复性评价分析结果

2.3.2 回收率评价

为考察GC对CPFAs的准确性，对建立方法的回收率进行了评价，结果如表4所示。从表4可知：锦葵酸的回收率在84.737%～108.037%之间，平均值为96.965%，RSD为10.865%；苹婆酸的回收率在84.388%～113.291%之间，平均值为97.447%，RSD为13.876%。说明此方法准确可靠。

表4 CG测定棉籽油中的CPFAs回收率实验结果

2.4 棉籽及其饼(粕)中的环丙烯脂肪酸含量

利用建立的环丙烯脂肪酸GC测定法分析了棉籽、棉籽饼和棉籽粕中锦葵酸和苹婆酸的含量，结果如表5所示。

表5 气相色谱测定棉籽及其饼(粕)中环丙烯脂肪酸含量

由表5可知：棉籽中锦葵酸和苹婆酸的含量分别为2.62 mg/g和1.02 mg/g；棉籽饼和棉籽粕中的锦葵酸含量分别为0.68 mg/g和0.09 mg/g，苹婆酸含量分别为0.27 mg/g和0.04 mg/g。

3 结 论

本文主要研究了棉籽及其饼(粕)中环丙烯脂肪酸含量的测定方法。通过探究碱式、简易碱式、硫酸催化甲酯化和三氟化硼甲酯化等4种衍生化方法，证实碱式甲酯化具有最佳效果；通过优化气相色谱条件得到最优条件为采用DB-1ht毛细管柱，氮气流速为 0.6 mL/min,升温程序为从100℃以2℃/min的速率上升到220℃，结合外标法定量。该方法的重复性和回收率良好。采用建立的方法测得棉籽、棉籽饼和棉籽粕中的锦葵酸含量分别为2.62、0.68 mg/g 和0.09 mg/g，苹婆酸含量分别为1.02、0.27 mg/g 和0.04 mg/g。该方法为棉籽及其饼(粕)中环丙烯脂肪酸量化测定提供了技术依据和指导，有利于为其在饲料工业中配方添加提供直接信息以及为环丙烯脂肪酸脱除提供技术支撑。