响应面试验优化碱提酸沉法提取微胚乳玉米蛋白工艺及其组成分析

卫 萍，张雅媛，游向荣，邓静友，周 葵，杨兆杏

(广西壮族自治区农业科学院 农产品加工研究所，广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西香蕉保鲜与加工工程技术研究中心，南宁 530007)

玉米，同小麦和稻谷并称为世界三大粮食作物[1]，在粮食作物中位居第3位[2]。我国是全球第二大玉米生产国，仅次于美国，玉米产量占世界总产量的20%[3]。普通玉米中含有70%的淀粉，主要用于生产玉米淀粉[4]，近年来发展了新型高油高蛋白玉米，改善了玉米籽粒的营养成分，研究新型高油高蛋白玉米具有显著的社会效益和经济效益。赖氨酸和色氨酸是必需氨基酸，只能从食物中摄取，高蛋白玉米中赖氨酸含量在0.4%以上，其色氨酸含量也比普通玉米高1倍左右。从食用价值方面来看，高蛋白玉米具有改善人体营养的作用，特别是对儿童的身体、智力发育大有裨益，对严重营养不良的儿童有一定的治疗作用，此外对预防癞皮病也有较好的疗效[5]。微胚乳玉米是一种新型高油高蛋白玉米，与普通玉米相比，胚乳含量极低，籽粒含油率高，油酸、VE、甾醇等有益营养成分多，具有玉米的特有香味，榨油后的粕蛋白质含量亦很高，且氨基酸组成合理，深加工潜力大。因而对新型微胚乳高蛋白玉米开展蛋白提取及性质研究，对其后续加工利用具有重要意义。

目前常用的蛋白提取方法有碱提酸沉法[6]、溶剂法[7]、酶法、反胶束萃取法[8]以及微波和超声波辅助提取法[9-10]等。其中碱提酸沉法因操作简单、易于控制、成本低廉等优点成为应用最多且已用于工业化的蛋白提取方法[6]。本研究首先采用单因素试验考察碱提酸沉法提取微胚乳玉米蛋白的主要工艺参数，然后以玉米蛋白得率为指标，采用响应面法优化获得微胚乳玉米蛋白的最优提取条件，然后对最优条件下提取的微胚乳玉米蛋白和普通玉米蛋白的组成进行了比较，以期为微胚乳高蛋白玉米的综合开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

微胚乳玉米(水分7.13%、粗脂肪24.7%、粗蛋白质21.6%、总淀粉27.1%、灰分3.2%)，广西益宝油料玉米有限公司；普通玉米(爆米花用)，广西南宁市广百佳超市；氢氧化钠、盐酸、冰乙酸、溴酚蓝、甘氨酸、甘油、过硫酸铵，均为分析纯；丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、考马斯亮蓝R250、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、N，N，N,N-四甲基乙二胺(TEMED，超纯级)、β-巯基乙醇(生化级)、标准蛋白，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

JY6002电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；RRH-100万能高速粉碎机，欧凯莱芙(香港)实业有限公司；L550低速大量离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；PHS-3C pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；XH-C涡旋混合器，江苏省金坛市荣华实验器材有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅，金坛市万华实验仪器厂；DYCZ-25E电泳仪，北京六一生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米蛋白等电点的确定

将微胚乳玉米干燥，然后准确称取50.0 g干微胚乳玉米，粉碎过0.18 mm(80目)筛，经索氏抽提脱脂后按1∶10的料液比加500 mL蒸馏水充分混匀，用1.0 mol/L NaOH调节pH至11，在50℃恒温水浴中振荡60 min后以4 000 r/min离心20 min，底部沉淀重复提取1次，将2次提取的上清液合并分别用1.0 mol/L HCl调pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，静置30 min出现分层，以4 000 r/min离心20 min，弃去上清液，沉淀经真空冷冻干燥后称质量，计算玉米蛋白得率。以pH为横坐标，玉米蛋白得率为纵坐标，绘制曲线，曲线中玉米蛋白得率最高的点对应的pH即为玉米蛋白的等电点。玉米蛋白得率按式(1)计算。

Y=m1/m0×100%

(1)

式中：Y为玉米蛋白得率；m1为玉米蛋白(沉淀)质量，g；m0干玉米粒质量，g。

1.2.2 碱提酸沉法提取玉米蛋白

准确称取一定量的干玉米粒，粉碎过0.18 mm(80目)筛，经索氏抽提脱脂后按一定料液比加蒸馏水充分混匀，用1.0 mol/L NaOH调节至一定的pH，置于一定温度的恒温水浴锅中振荡提取一定时间后，离心取上清液用1.0 mol/L HCl调pH至玉米蛋白等电点，静置，待玉米蛋白沉降后以10 000 r/min离心10 min，取沉淀真空冷冻干燥后即得玉米蛋白。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

参照卫萍等[11]的方法进行SDS-PAGE分析，其中样品制备方法略有修改。样品制备方法：分别称取1 mg玉米蛋白溶于5 mL 2倍蛋白样品缓冲液中，涡旋混合器混匀溶解成透明的深蓝色溶液，沸水浴中煮沸10 min使蛋白质充分变性。

1.2.4 氨基酸组成分析

参考GB 5009.124—2016测定样品的氨基酸组成。

1.2.5 数据处理

每个试验重复3次。单因素试验数据利用SPSS17.0软件进行方差分析，并用Origin 8.1软件进行绘图，响应面试验采用Design Expert 8.0.6.1软件进行多元回归拟合及工艺参数优化。

2 结果与分析

2.1 玉米蛋白的等电点

按1.2.1方法测定玉米蛋白等电点，pH与玉米蛋白得率的关系见图1。

图1 pH对玉米蛋白得率的影响

由图1可知，随着pH的升高，玉米蛋白得率先升高后下降。在pH为5.0时，玉米蛋白得率达到最大值，为19.54%。这是因为在等电点时蛋白质分子颗粒在溶液中不存在同电荷的相互排斥作用，其颗粒极易相互碰撞凝聚而沉淀析出，此时溶液中蛋白质的溶解度最小[10]。因此，确定玉米蛋白的等电点为5.0。另外，试验中发现二次提取对玉米蛋白得率影响较小，故后续试验使用一次提取工艺，以便节约时间和成本。

2.2 微胚乳玉米蛋白提取单因素试验

2.2.1 料液比对玉米蛋白得率的影响

在提取温度50℃、提取时间60 min、提取pH 11条件下，考察料液比对玉米蛋白得率的影响，结果见图2。

图2 料液比对玉米蛋白得率的影响

由图2可知，随着料液比的增加，玉米蛋白得率先迅速增加后缓慢增加。在料液比为1∶5时，玉米蛋白得率最低，为9.51%，在料液比为1∶10时玉米蛋白得率迅速增加至18.93%。这是因为在料液比较低时，一方面提取体系黏度大，分子扩散速率低，蛋白质分子的溶出速率低，另一方面蛋白质浓度较高，分子间的相互排斥力阻碍更多蛋白质的溶出[12]，而随料液比的增加，稀释作用加强，提取体系的黏度和蛋白质浓度都有所下降，蛋白质溶出增加，从而使玉米蛋白得率增加。但当料液比超过1∶10时，玉米蛋白得率增加放缓，并且与料液比1∶10时的玉米蛋白得率差异不显著(p>0.05)。分析原因可能是蛋白质的溶解度达到饱和状态，继续增加溶剂蛋白质溶解也不明显[13]。综合考虑，料液比为1∶10 左右较适宜。

2.2.2 提取pH对玉米蛋白得率的影响

在提取温度50℃、提取时间60 min、料液比1∶10的条件下，考察提取pH对玉米蛋白得率的影响，结果见图3。由图3可知，随着提取pH的升高，玉米蛋白得率逐渐增大，在提取pH为11.5时达到最大，为18.56%。原因在于碱液能使细胞紧密结构变得疏松，破坏蛋白质分子的次级键特别是氢键，使玉米蛋白质分子表面带有相同电荷，促进结合物与蛋白质的分离，使蛋白得率增加[14-15]。当提取pH大于11.5时，玉米蛋白得率反而降低，原因可能是蛋白质水解导致的[10]。另外，试验中发现，随着提取pH的升高，玉米蛋白的颜色会变深。因此，选择提取pH为11.5左右较适宜。

图3 提取pH对玉米蛋白得率的影响

2.2.3 提取温度对玉米蛋白得率的影响

在提取时间60 min、提取pH 11、料液比1∶10的条件下，考察提取温度对玉米蛋白得率的影响，结果见图4。

图4 提取温度对玉米蛋白得率的影响

由图4可知，随着提取温度的升高，玉米蛋白得率先增大后减小，在提取温度为50℃时，玉米蛋白得率最大，为18.35%，这与任秀艳等[16]研究获得的最佳提取温度一致。当提取温度高于50℃后，玉米蛋白得率开始显著下降。分析原因可能是温度较高时，水发生了解离，Sereewatthanawut等[17]利用色谱分析也证明了水的解离现象，同时在高温条件下蛋白质会发生降解，共同造成了玉米蛋白得率的降低。因此，选择提取温度50℃左右较适宜。

2.2.4 提取时间对玉米蛋白得率的影响

在提取温度50℃、提取pH 11、料液比1∶10的条件下，考察提取时间对玉米蛋白得率的影响，结果见图5。

图5 提取时间对玉米蛋白得率的影响

由图5可知，随着提取时间的延长，玉米蛋白得率增加，在提取时间为90 min时，玉米蛋白得率达到最大，为18.10%，之后玉米蛋白得率随着提取时间的延长反而降低。分析原因可能是提取时间太长，玉米蛋白发生部分变性或降解。因此，适宜的提取时间为90 min左右。

2.3 微胚乳玉米蛋白提取响应面试验

2.3.1 响应面试验设计及结果

根据单因素试验，以料液比(A)、提取pH(B)、提取温度(C)及提取时间(D)4个因素为自变量，以玉米蛋白得率(Y)为响应值，采用中心组合设计进行响应面试验，响应面试验因素与水平见表1，响应面试验方案及结果见表2。

表1 响应面试验因素及水平

表2 响应面试验方案及结果

续表2

2.3.2 回归模型的建立及方差分析

对表2试验数据进行拟合，得到二次多项回归方程：Y=18.44+1.10A+0.30B+2.500E-003C-0.69D-0.23AB+0.038AC+0.22AD-0.68BC-0.071BD+0.29CD-6.042E-003A2-0.62B2+0.038C2-0.39D2。对回归模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析

由表3可知，模型的p小于0.000 1，表明模型差异极显著，失拟项p为0.359 9，大于0.05，表明失拟项不显著，说明未知因素对结果干扰很小，该模型基本能反映料液比、提取pH、提取温度及提取时间与玉米蛋白得率的关系，可以用此模型分析和预测碱提酸沉法提取玉米蛋白的结果。由F值可以看出各因素影响主次顺序为A(料液比)>D(提取时间)>B(提取pH)>C(提取温度)。由p值可知AB、AD交互作用差异高度显著(p<0.01)，BC、CD交互作用差异极显著(p<0.001)。

通过对回归模型求偏导，得到玉米蛋白提取的最优工艺条件为料液比1∶14.75、提取pH 11.4、提取温度48.95℃、提取时间61.20 min，在此条件下玉米蛋白得率的预测值为20.42%。

2.3.3 验证试验

为了检验模型预测的准确性，采用响应面优化的工艺条件进行玉米蛋白提取试验，考虑实际操作的便利，将最优工艺条件修正为料液比1∶15、提取pH 11.5、提取温度50℃、提取时间60 min。试验重复3次，实际玉米蛋白得率平均值为20.40%，与理论得率20.42%的相对误差为0.10%，无显著性差异，说明模型可以很好地预测微胚乳玉米蛋白提取情况。

2.4 玉米蛋白的分子质量分布

分别以微胚乳玉米和普通玉米为原料，按照1.2.2方法，在响应面优化的微胚乳玉米蛋白提取最优工艺条件下，提取微胚乳玉米蛋白和普通玉米蛋白，并对两种蛋白进行SDS-PAGE分析，结果见图6。

注：条带1、2、3、4分别代表Marker(标准蛋白)、普通玉米蛋白、微胚乳玉米蛋白、Marker图6 玉米蛋白SDS-PAGE分析图

以标准蛋白的迁移率和分子质量对数制作工作曲线，再根据被测蛋白的迁移率估算其分子质量。由图6可见，微胚乳玉米蛋白与普通玉米蛋白出现条带的位置基本一致，且分子质量分布均小于60 kDa，普通玉米蛋白有5条主带，分子质量分别为55.59、40.62、30.46、24.82、19.21 kDa，微胚乳玉米蛋白亦有5条主带，分子质量分别为55.59、40.62、30.46、24.82、18.14 kDa，但是二者在15～20 kDa之间出现的条带略有不同，说明微胚乳玉米蛋白与普通玉米蛋白组成有区别，这可能会导致二者加工性质方面有所差异，有待进一步研究验证。

2.5 玉米蛋白的氨基酸组成

对最优工艺条件下提取的微胚乳玉米蛋白和普通玉米蛋白的氨基酸组成进行分析，结果如表4所示。

表4 玉米蛋白氨基酸组成及含量 %

由表4可见，玉米蛋白中共检出16种氨基酸，种类较为齐全，未检测到色氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和胱氨酸，可能是因为在酸性条件下水解，色氨酸被沸酸完全破坏，天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基也被水解成了羧基。普通玉米蛋白和微胚乳玉米蛋白包含7种人体必需氨基酸(色氨酸除外)，分别占氨基酸总量的35.44%和36.15%，两种玉米蛋白的蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、组氨酸含量较少，但是谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、天门冬氨酸含量较高，其中普通玉米蛋白这4种氨基酸分别占氨基酸总量的16.92%、9.50%、7.56%和7.50%，微胚乳玉米蛋白这4种氨基酸分别占氨基酸总量的17.56%、11.77%、7.09%和7.49%。高含量的谷氨酸是表征玉米蛋白的一个重要特性，这与唐红明[18]报道的结果相似。谷氨酸可促进机体生物代谢，提高大脑思维活跃水平，可用于治疗神经衰弱和记忆力减退[19]。

3 结 论

在单因素试验的基础上，利用响应面法建立了微胚乳玉米蛋白提取工艺的二次项数学模型，该模型拟合度良好。影响微胚乳玉米蛋白得率的因素主次顺序为料液比>提取时间>提取pH>提取温度，最优提取工艺条件为料液比1∶15、提取pH 11.5、提取温度50℃、提取时间60 min。在最优条件下，微胚乳玉米蛋白得率为20.40%。对最优条件下提取的微胚乳玉米蛋白与普通玉米蛋白进行SDS-PAGE分析，二者出现的条带位置基本一致，只是在15～20 kDa出现的条带略有不同。两种玉米蛋白的氨基酸种类一致，较为齐全，同时谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、天门冬氨酸含量较高，其中微胚乳玉米蛋白的必需氨基酸含量较普通玉米蛋白高。本试验结果为进一步研究利用新型微胚乳玉米蛋白提供了良好的研究基础。