STAT3基因多态性与儿童毛细支气管炎易感性以及外周血IL-9、IL-17相关性研究

何文琴，瞿梦婷，郭建新，阿布来提·阿不都哈尔

（新疆医科大学第一附属医院小儿急危重症医学科，乌鲁木齐830054）

毛细支气管炎是儿童常见的下呼吸道感染，以细支气管受累为特征，在2岁以下儿童中高发，临床表现为喘咳、憋闷等症状，被认为是诱发儿童支气管哮喘和反复喘息的危险因素[1]。研究发现[12-13]，毛细支气管炎患儿治疗后反复喘息的发生率高达85%，3~5年内进展为哮喘的发生率为35.83%。毛细支气管炎常由病毒感染引起，其中个体遗传与环境因素也有一定的作用，因此在毛细支气管炎疾病的防治中，明确与个体遗传相关的易感性基因具有重要意义[2-3]。信号传导与转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是一种重要的核转录因子，在免疫调控、感染、肿瘤发生等病理生理活动中有重要作用[4]。研究发现STAT3在病毒感染的发病机制中有重要作用，在严重急性呼吸综合征冠状病毒、人类偏肺病毒等病毒感染中出现前病毒功能[5]。Antunes等发现STAT3与呼吸道合胞病毒感染引起毛细支气管炎的发生有关[6]。有研究发现STAT3基因多态性与过敏性紫癜、哮喘等多种疾病的易感性相关[7-8]，提示相同的基因多态性可通过共同的致病信号通路影响不同疾病。STAT3的rs2293152、rs957970两位点是目前被研究最多的两个位点，但其基因多态性是否可影响毛细支气管炎的发生发展尚未明确。白细胞介素9（Interleukin-9，IL-9）与白细胞介素17（Interleukin-17，IL-17）均是白细胞介素家族成员，在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节中有重要作用，且参与毛细支气管炎的发生发展[9-10]。本研究对STAT3基因多态性与儿童毛细支气管炎易感性及外周血IL-9、IL-17的相关性进行研究，以期为儿童毛细支气管炎的防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年6月-2020年6月新疆医科大学第一附属医院小儿急危重症医学科收治的毛细支气管炎患儿60例为试验组，纳入标准：（1）符合《毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识(2014年版)》制定的毛细支气管炎诊断标准[11]；（2）入院前未接受相关治疗。排除标准：（1）合并有川崎病、炎症性肠病等免疫相关疾病者及合并结核等慢性感染性疾病者；（2）存在先天性呼吸道畸形或发育不良者。以性别、年龄为对照选取同期在儿童保健科体检结果为健康的儿童60例为对照组。试验组患儿男性34例，女性26例，年龄2~28个月，平均年龄（18.56±5.42）个月；对照组患儿男性33例，女性27例，年龄1~30个月，平均年龄（18.55±5.60）个月，两组患儿性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。收集患儿身高、体重、被动吸烟等资料。本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审核批准，患儿家长均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 STAT3基因多态性（rs2293152、rs957970）检测 采集受检儿童外周静脉血4 mL置于抗凝试管中，取2 mL以DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取DNA，样本置于-20℃保存。PCR反应（引物由上海生工生物工程股份有限公司合成）：rs2293152：上游引物5’-AACGCGCCTACTTCTTTCCTGCCC-3’，下游引物5’-TAAGTTCCTCTCCTGGCTGTTCCG-3’；rs957970：上游引物5’-CTTATGACATTCTCCAGGTTCATC-3’，下游引物5’-TCTCGTCACGTTTACAAGTAATGCT-3’。PCR反应体系20μL：上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，质控正向0.5μL，通用反向引物1μL，2×Power Taq Master Mix 12.5μL，ddH2O 4μL。反应条件：预变性94℃4 min，变性94℃30 s，退火65℃50 s，延伸72℃4 s，重复25个循环，再次72℃延伸4 min。酶切及测序：37℃酶切过夜，每个样本取5 μL产物加入1.5%琼脂糖凝胶中，使用凝胶成像系统记录基因型条带。

1.2.2 外周血IL-9、IL-17检测 取剩余2 mL血液以3 000 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，弃上层清液，使用酶联免疫吸附实验试剂盒（厦门慧嘉生物科技有限公司）检测IL-9、IL-17水平。

1.2.3 儿童毛细支气管炎严重程度判断 参照《毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识2014年版》[11]，将符合重度标准者纳为重型毛细支气管炎，符合轻-中度标准者纳为普通型毛细支气管炎，见表1。

1.3 统计学处理采用SPSS24.0统计学软件进行数据分析与处理，计数资料使用[n（%）]表示，数据比较采用2χ检验，计量资料以（±s）表示，数据比较采用t检验，STAT3基因rs2293152、rs957970位点基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡检验；以Logistic回归分析STAT3基因多态性与毛细支气管炎发生的关系,以P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 患儿病情严重度分级

2 结果

2.1 试验组与对照组一般资料比较两组性别、年龄、身高、体重、家中饲养宠物、个人过敏史、家族过敏史、被动吸烟、就诊季节比较，差异无统计学意义（P＞0.05），试验组的早产、哮喘家族史占比高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.2 试验组与对照组STAT3基因型及等位基因分布比较试验组STAT3基因rs2293152位点CC基因型与C等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；试验组与对照组STAT3基因rs957970位点的基因型及等位基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）,见表3、4。

表2 试验组与对照组一般资料比较

表3 试验组与对照组STAT3 rs2293152位点基因型与等位基因分布频率[n（%）]

表4 试验组与对照组STAT3 rs957970位点基因型与等位基因分布频率[n（%）]

2.3 试验组中STAT3 rs2293152位点基因型血清IL-9、IL-17水平比较STAS3基因rs2293152位点CC基因型血清IL-9、IL-17水平高于CG、GG基因型，差异有统计学意义（P＜0.05），CG基因型与GG基因型外周血IL-9、IL-17水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表5 试验组中STAT3 rs2293152位点基因型血清IL-9、IL-17水平比较

2.4 试验组病情不同严重程度STAT3 rs2293152位点基因型及血清IL-9、IL-17水平比较重型毛细支气管炎者STAS3基因rs2293152位点CC基因型占比及血清IL-9、IL-17高于普通型，差异有统计学意义（P＜0.05）。重型毛细支气管炎者STAS3基因rs2293152位点CG与GG型基因占比与普通型比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表6。

表6 不同严重程度STAT3 rs2293152位点基因型及血清IL-9、IL-17水平比较

2.5 Logistic回归分析STAS3基因rs2293152位点多态性与毛细支气管炎的关系以是否有毛细支气管炎为因变量（否=0，是=1），以STAS3基因rs2293152位点基因型（GG=0，CG=1，CC=2）、等位基因（G=0，C=1）、早产（否=0，是=1）、哮喘家族史（无=0，有=1）、IL-9、IL-17水平为自变量进入Logistic回归分析模型，结果显 示STAS3基因rs2293152位点CC基 因 型、C等位基因、早产、哮喘家族史是导致儿童发生毛细支气管炎的影响因素（P＜0.05），见表7。

表7 Logistic回归分析STAS3基因rs2293152位点多态性与毛细支气管炎关系

3 讨论

目前病毒感染及环境因素已在儿童毛细支气管炎的发病机制中明确，但遗传因素仍未清晰。近年来宿主基因易感性成为疾病发生机制研究热点，了解某一易感基因位点的多态性，可为毛细支气管炎发生过程中个体表型差异、疾病的预防、诊断和治疗提供遗传因素解释[14]，通过基因分析利于及早对高危儿童采取防治措施，降低毛细支气管炎及支气管哮喘发病率。

STAT3是具有信号转导和调控双重功能的DNA结合蛋白，持续激活后可诱导细胞的增殖、分化、凋亡相关基因的表达，对细胞生理功能有重要的调控作用[15]。STAT3内含子11rs2293152与内含子23 STAT3 rs957970存在单个核苷酸多态性，其中rs2293152位点被证实与炎症性肠病、白塞病等免疫性疾病的易感性有关[16-17]。张耀文等[18]发现，IL-6/STAT3信号通路参与儿童喘息性支气管炎的发生发展。Lu等[19]在动物实验研究中证实秋水仙碱能抑制呼吸道合胞病毒诱导的气道炎症和STAT3的磷酸化，说明STAT3参与毛细支气管炎在内的呼吸道疾病的发生。钟芳芳等[20]研究中显示，川南地区儿童中STAT3基因rs2293152位点的CC、CG、GG基因型分布分别为19.2%、45.4%、35.4%，与本研究中对照组的10.00%、50.00%、40.00%相近，研究证实rs2293152多态性与儿童支气管哮喘易感性相关。通过上述研究证实STAT3基因rs2293152位点与支气管哮喘、过敏性紫癜等自身免疫性疾病及感染性疾病有关，毛细支气管炎作为呼吸道炎症性疾病，与STAT3基因rs2293152位点的关系尚无定论。在本研究中，与对照组比较，试验组中rs2293152位点CC基因型与C等位基因频率更高，两组rs957970位点C/T基因型分布及基因频率比较无统计学差异，Logistic回归分析显示STAT3基因rs2293152位点CC基因型与C等位基因携带者毛细支气管炎的患病风险是非携带者 的2.356（95%CI:0.312~1.201）与1.931（95%CI:1.225~2.037）倍，提示除早产及家族哮喘史等因素外，STAT3基因rs2293152位点C/G基因的多态性与儿童毛细支气管炎的易感性相关，rs957970位点C/T基因多态性与儿童毛细支气管炎的易感性无关。

免疫功能失调是儿童毛细支气管炎发病的重要机制，辅助性T细胞（Th细胞）在呼吸道炎症性疾病中发挥重要的免疫调节作用。IL-9由Th9细胞特征性分泌，参与包括毛细支气管炎在内的多种感染性疾病、过敏性疾病和自身免疫性疾病的发生，可通过激活炎症细胞，促进炎性因子与趋化因子的分泌，导致靶器官发生炎性损伤[21]。Xu等[22]发现毛细支气管炎患儿支气管肺泡灌洗液中存在IL-9水平异常升高，且其水平变化与肺功能密切相关。Feng等[23]发现IL-9细胞主要通过肥大细胞发挥生物学效应，介导JAK/STAT信号通路参与免疫调节与免疫应答。IL-17由CD4+T细胞分泌，是Th17细胞的效应细胞，能促进T细胞的激活，并刺激上皮细胞、内皮细胞、粒细胞-巨噬细胞刺激因子等介导炎症反应[24]。McGill等[25]认为，IL-17在呼吸道合胞病毒感染儿童中的表达增加，且表达水平的增加对呼吸道合胞病毒感染相关性疾病的发展有负面影响。以上研究说明IL-9、IL-17参与毛细支气管炎的发生发展。

本研究结果显示试验组STAT3基因rs2293152位点CC基因型血清IL-9、IL-17水平均高于CG基因型与GG基因型，重型毛细支气管炎者STAS3基因rs2293152位点CC基因型占比及血清IL-9、IL-17水平高于普通型，说明STAT3 rs2293152位点CC基因型与外周血IL-9、IL-17水平的升高及疾病严重程度有关，既往研究从外周血水平证实了IL-9、IL-17参与毛细支气管炎的发生发展，为本次研究结论提供了依据，因此推测STAT3 rs2293152位点CC基因型可能在重型毛细支气管炎发生发展的中有重要作用。

综上所述，在STAT3基因rs2293152位点CC基因型与C等位基因与儿童毛细支气管炎的易感性有关，且CC基因型与外周血IL-9、IL-17水平的升高及病情严重程度有关。本研究的局限性在于仅通过临床数据分析STAT3基因多态性与儿童毛细支气管炎易感性及外周血IL-9、IL-17的关系，对于其内在机制研究仍需进一步通过动物或细胞等基础实验研究探索。