MTHFD1基因多态性与大肠癌遗传易感性的研究

彭勇　崔建华　赵新华等

[摘要] 目的 探讨MTHFD1基因多态性与大肠癌遗传易感性的相关性。方法 对96例大肠癌患者及96例健康体检者采取问卷调查表的形式，选用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测的方法。 结果 大肠癌患者中MTHFD1基因多态性G1958A位点rs2236225等位基因的频率与健康对照组比较有显著性差异（P<0.05）；rs2236225基因型者大肠癌的发病风险增加1.6倍（OR=1.603，95%CI=0.331～2.534，P<0.05）。 结论 MTHFD1基因多态性密切相关于大肠癌的易感性，MTHFD1多态性G1958A位点rs2236225基因改变是大肠癌的主要发病原因。

[关键词] 亚甲基四氢；叶酸脱氢酶；基因多态性；大肠癌；易感性

[中图分类号] R735.34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）23-0001-03

[Abstract] Objective To explore the correlation of MTHFD1 gene polymorphism with genetic susceptibility to colorectal cancer. Methods Ninety-six cases of colorectal cancer patients and 96 cases of healthy controls were investigated by questionnaire， the polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） detection method was applied. Results Compared with normal control group， MTHFD1 G1958A polymorphism rs2236225 locus allele frequencies of patients with colorectal cancer had significant difference（P <0.05）； rs2236225 genotype risk of colorectal cancer increased 1.6 times（OR=1.603， 95%CI=0.331～2.534， P<0.05）. Conclusion MTHFD1 gene polymorphism is closely related to the susceptibility of colorectal cancer， the main course of colorectal cancer is the rs2236225 gen changes in G1958A site of MTHFD1.

[Key words] Methylenetetrahydrofolate； Folic acid dehydrogenase； Gene polymorphism； Colorectal cancer； Susceptibility

大肠癌是较为常见的消化道肿瘤之一，近年来，随着全球环境及人们饮食结构的改变，大肠癌在全球的发病率呈逐年上升趋势。据流行病学研究显示，全世界每年约有100万新发病例，且约有50万患者死于大肠癌。目前如何提高患者治疗效果、延长患者生存时间是临床和基础研究亟待解决的问题[1]。

亚甲基四氢叶酸脱氢酶在叶酸一碳单位代谢的过程中起着非常关键的作用，可催化3个连续反应，且已有文献报道MTHFD1基因多态性可能和大肠癌的发生有显著关系[2]。本组研究就我院96例大肠癌患者采用PCR-RFLP法检测大肠癌及健康受试者血清学基因型变化，分析MTHFD1基因多态性和大肠癌遗传易感性之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取本院2010年12月～2012年12月来自宁乡县本地192例调查者为研究对象（包括96例大肠癌患者以及96例同期健康体检者）。其中大肠癌患者（观察组）男54例，女42例，年龄46～76岁，平均（54.7±6.3）岁， AJCC/UICC大肠癌TNM分期情况：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者分别有15例、4例、76例、1例。健康对照组96例，其中，男55例，女41例，年龄46～77岁，平均（54.2±6.8）岁，经统计学分析两组在年龄、性别等方面无显著性差异，具有可比性（P>0.05）。

1.2 试验材料

引物：由北京奥科、擎科、赛百胜生物技术有限责任公司在DNA自动合成仪上合成，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化。HotStar DNA聚合酶购自Qiagen公司；Ex-Tap、LA-Tap、dNTP、Buffer和DL2000 DNA marker购自TaKaRa公司；琼脂糖购自Gibcol公司；核酸限制性内切酶购自TaKaRa公司。

1.3 引物设计

MTHFD1G1958A正向引物 5-CCCACTTTGAA GCAGGATTG-3；MTHFD1G1958A反向引物 5-CATCCCAATTCCCCTGATG-3。

1.4 方法

所有参与实验的受试者于问卷调查完成的次日清晨空腹抽取5 mL外周全血，基因组DNA提取的方式采用盐析法，提取后定量到10 ng/μL，本实验通过伦理委员会批准且受试者均签署了知情同意书。

1.4.1 盐析法提取血液基因组DNA 取5 mL血样置于含EDTA-Na2管内，然后置于50 mL的有盖离心管内；然后加入5～8倍体积（约40 mL）冷蒸馏水，通过反复颠倒的方式将其混匀后置于冰中5 min，在4℃的温度条件下以3750 rpm离心20 min；离心后将上清液缓慢倒出，加入浓度为0.1%的 Trition-x100（预冷处理后）至沉淀中，摇匀后重复上述操作；为完全打碎沉淀，可倒入2 mL的裂解液，再加入10%浓度为5%左右的 SDS 100 μL，混匀；将浓度10 mg/mL的蛋白酶K 40～50 μL加入其中直至浓度为200 μg/mL，混匀后在55℃的条件下放置3 h或者在37℃温度下过夜消化；添加0.7 mL的6.0 M NaCl后剧烈震荡20 s；然后以3750 rpm离心40 min，将上清倒至50 mL有盖离心管内；加入2倍体积的冷无水乙醇，反复颠倒混匀处理至絮状DNA沉淀出现，将其中1.5 mL的DNA挑出置于EP管内，用浓度为80%的冷乙醇洗涤两遍后抽干；为溶解DNA向其中加入TE 200 μL；定量至5～10 ng/μL，在96孔PCR板中制成DNA板，然后存于-20℃冰箱以备用。

1.4.2 PCR-RFLP法分型 按照GenBank现有的基因序列注释方法，编辑并注释基因序列，核酸限制性内切酶位点的选择、引物的设计分别使用DNAMAN软件和软件Primer3.0进行处理。PCR扩增方式按表1进行；酶切上述3～5 μL 的PCR产物，过夜。经琼脂糖凝胶电泳法对酶切产物进行分型；纤细记录分型的结果并给予统计学处理分析；验证分型的准确性可随机选取其中15%的分型样本进行测序处理。

3 讨论

大肠癌可对患者的生活质量造成十分严重的影响，是一种十分常见的恶性肿瘤。据流行病学调查研究显示，在北美、欧洲各国，大肠癌的死亡率占全部癌症死亡原因的第2位[3]。现有大量相关研究证明在大肠癌病情发展的过程中，许多基因及细胞因子发挥着关键性作用[4]。

定位于14q24的MTHFD1 基因共编码氨基酸935个，总共对应三种具有不同活性的蛋白酶，分别为：5、10 亚甲基四氢叶酸脱氢酶，5、10 次甲基四氢叶酸环式水解酶和10甲基四氢叶酸合成酶，这三种蛋白酶均可催化四氢叶酸一碳单位交换过程中的3个连续反应。其中MTHFD1 基因的内部存在多个基因的突变位点，以G1958A（rs2236225）最多，G1958A（rs2236225）位点的突变会导致密码子653 所编码谷氨酸转变为精氨酸，由于这一变异发生于10 甲基四氢叶酸合成酶的活性区域内部，因此出现突变会影响叶酸同型半胱氨酸代谢，导致核酸合成障碍和DNA 的低甲基化作用，最终引发产生染色体畸变[5]。

本研究对本院96例大肠癌患者进行研究，并以同期96例健康体检者作为对照，应用PCR-RFLP检测法检测大肠癌人群的外周血中亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因多态性情况，结果发现观察组中58例含GG基因型，26例含GA基因型，12例含AA基因型；而对照组中60例含GG基因型，32例含GA基因型，4例含AA基因型，MTHFD1 基因rs2236225 位点等位基因频率分布在大肠癌患者和健康受试者之间存在统计学差异（P<0.05）；计算观察组与对照组突变等位基因G相对于等位基因A（OR=1.603，95%CI=0.331～2.534，P<0.05），rs2236225基因型者大肠癌的发病风险增加1.6倍。

本研究结果显示：大肠癌组MTHFD1基因rs2236225基因型分布频率和等位基因频显著异于健康受试者，差异有统计学意义（P<0.05）；MTHFD1 基因rs2236225多态是导致大肠癌的易感性的主要因素，而G/A杂合子可以有效降低大肠癌的发病率，是大肠癌的重要保护因素。目前已有研究表明，可导致DNA的甲基化的唯一因素是T/T基因型患者叶酸摄入水平过低。但是，关于MTHFR基因多态导致大肠癌易感性降低的作用方式仍然有待于进一步分析研究[6，7]。

综上所述，MTHFD1基因多态性与大肠癌的易感性显著相关，这可能为大肠癌分子治疗提供依据。

[参考文献]

[1] Bijnsdorp IV，Kruyt FA，Fukushima M，et al. Molecular mechanism underlying the synergistic interaction between trifluorothymidine and the epidermal growth factor receptor inhibitor erlotinib in human colorectal cancer cell lines[J]. Cancer Sci，2010，101（2）：440-447.

[2] 张艳玲，苑晓燕，张冲，等. 胸苷酸合成酶基因及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与辽宁本溪人群结直肠癌易感性的关系研究[J]. 临床肿瘤学杂志，2008，13（9）：769-773.

[3] 朱凡，王敏明，张勤英. 血浆同型半胱氨酸、血清叶酸及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与结、直肠癌发病关系的研究[J]. 东南大学学报，2010，29（1）：88-92.

[4] 于兆亚，汤静. hOGG1基因多态性与胃癌遗传易感性的关系[J]. 中国医药科学，2013，3（20）：27-29.

[5] 沈晓波，池圣亮. 抑癌基因PTEN在大肠癌中的表达及临床意义[J]. 中国现代医生，2013，51（33）：53-54，57.

[6] 周丽娜，谭悦，徐燕，等. 结直肠癌易感性与CYP1A1基因多态性关系的Meta分析[J]. 肿瘤研究与临床，2013，25（8）：535-538.

[7] 孙静锋，张冬，闻鉴非，等. XRCC1R399Q基因多态性与结直肠癌易感性的Meta分析[J]. 中国肿瘤外科杂志，2013，5（2）：95-98.

（收稿日期：2014-05-19）

1.4.2 PCR-RFLP法分型 按照GenBank现有的基因序列注释方法，编辑并注释基因序列，核酸限制性内切酶位点的选择、引物的设计分别使用DNAMAN软件和软件Primer3.0进行处理。PCR扩增方式按表1进行；酶切上述3～5 μL 的PCR产物，过夜。经琼脂糖凝胶电泳法对酶切产物进行分型；纤细记录分型的结果并给予统计学处理分析；验证分型的准确性可随机选取其中15%的分型样本进行测序处理。

3 讨论

大肠癌可对患者的生活质量造成十分严重的影响，是一种十分常见的恶性肿瘤。据流行病学调查研究显示，在北美、欧洲各国，大肠癌的死亡率占全部癌症死亡原因的第2位[3]。现有大量相关研究证明在大肠癌病情发展的过程中，许多基因及细胞因子发挥着关键性作用[4]。

定位于14q24的MTHFD1 基因共编码氨基酸935个，总共对应三种具有不同活性的蛋白酶，分别为：5、10 亚甲基四氢叶酸脱氢酶，5、10 次甲基四氢叶酸环式水解酶和10甲基四氢叶酸合成酶，这三种蛋白酶均可催化四氢叶酸一碳单位交换过程中的3个连续反应。其中MTHFD1 基因的内部存在多个基因的突变位点，以G1958A（rs2236225）最多，G1958A（rs2236225）位点的突变会导致密码子653 所编码谷氨酸转变为精氨酸，由于这一变异发生于10 甲基四氢叶酸合成酶的活性区域内部，因此出现突变会影响叶酸同型半胱氨酸代谢，导致核酸合成障碍和DNA 的低甲基化作用，最终引发产生染色体畸变[5]。

本研究对本院96例大肠癌患者进行研究，并以同期96例健康体检者作为对照，应用PCR-RFLP检测法检测大肠癌人群的外周血中亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因多态性情况，结果发现观察组中58例含GG基因型，26例含GA基因型，12例含AA基因型；而对照组中60例含GG基因型，32例含GA基因型，4例含AA基因型，MTHFD1 基因rs2236225 位点等位基因频率分布在大肠癌患者和健康受试者之间存在统计学差异（P<0.05）；计算观察组与对照组突变等位基因G相对于等位基因A（OR=1.603，95%CI=0.331～2.534，P<0.05），rs2236225基因型者大肠癌的发病风险增加1.6倍。

本研究结果显示：大肠癌组MTHFD1基因rs2236225基因型分布频率和等位基因频显著异于健康受试者，差异有统计学意义（P<0.05）；MTHFD1 基因rs2236225多态是导致大肠癌的易感性的主要因素，而G/A杂合子可以有效降低大肠癌的发病率，是大肠癌的重要保护因素。目前已有研究表明，可导致DNA的甲基化的唯一因素是T/T基因型患者叶酸摄入水平过低。但是，关于MTHFR基因多态导致大肠癌易感性降低的作用方式仍然有待于进一步分析研究[6，7]。

综上所述，MTHFD1基因多态性与大肠癌的易感性显著相关，这可能为大肠癌分子治疗提供依据。

[参考文献]

[1] Bijnsdorp IV，Kruyt FA，Fukushima M，et al. Molecular mechanism underlying the synergistic interaction between trifluorothymidine and the epidermal growth factor receptor inhibitor erlotinib in human colorectal cancer cell lines[J]. Cancer Sci，2010，101（2）：440-447.

[2] 张艳玲，苑晓燕，张冲，等. 胸苷酸合成酶基因及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与辽宁本溪人群结直肠癌易感性的关系研究[J]. 临床肿瘤学杂志，2008，13（9）：769-773.

[3] 朱凡，王敏明，张勤英. 血浆同型半胱氨酸、血清叶酸及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与结、直肠癌发病关系的研究[J]. 东南大学学报，2010，29（1）：88-92.

[4] 于兆亚，汤静. hOGG1基因多态性与胃癌遗传易感性的关系[J]. 中国医药科学，2013，3（20）：27-29.

[5] 沈晓波，池圣亮. 抑癌基因PTEN在大肠癌中的表达及临床意义[J]. 中国现代医生，2013，51（33）：53-54，57.

[6] 周丽娜，谭悦，徐燕，等. 结直肠癌易感性与CYP1A1基因多态性关系的Meta分析[J]. 肿瘤研究与临床，2013，25（8）：535-538.

[7] 孙静锋，张冬，闻鉴非，等. XRCC1R399Q基因多态性与结直肠癌易感性的Meta分析[J]. 中国肿瘤外科杂志，2013，5（2）：95-98.

（收稿日期：2014-05-19）

1.4.2 PCR-RFLP法分型 按照GenBank现有的基因序列注释方法，编辑并注释基因序列，核酸限制性内切酶位点的选择、引物的设计分别使用DNAMAN软件和软件Primer3.0进行处理。PCR扩增方式按表1进行；酶切上述3～5 μL 的PCR产物，过夜。经琼脂糖凝胶电泳法对酶切产物进行分型；纤细记录分型的结果并给予统计学处理分析；验证分型的准确性可随机选取其中15%的分型样本进行测序处理。

3 讨论

大肠癌可对患者的生活质量造成十分严重的影响，是一种十分常见的恶性肿瘤。据流行病学调查研究显示，在北美、欧洲各国，大肠癌的死亡率占全部癌症死亡原因的第2位[3]。现有大量相关研究证明在大肠癌病情发展的过程中，许多基因及细胞因子发挥着关键性作用[4]。

定位于14q24的MTHFD1 基因共编码氨基酸935个，总共对应三种具有不同活性的蛋白酶，分别为：5、10 亚甲基四氢叶酸脱氢酶，5、10 次甲基四氢叶酸环式水解酶和10甲基四氢叶酸合成酶，这三种蛋白酶均可催化四氢叶酸一碳单位交换过程中的3个连续反应。其中MTHFD1 基因的内部存在多个基因的突变位点，以G1958A（rs2236225）最多，G1958A（rs2236225）位点的突变会导致密码子653 所编码谷氨酸转变为精氨酸，由于这一变异发生于10 甲基四氢叶酸合成酶的活性区域内部，因此出现突变会影响叶酸同型半胱氨酸代谢，导致核酸合成障碍和DNA 的低甲基化作用，最终引发产生染色体畸变[5]。

本研究对本院96例大肠癌患者进行研究，并以同期96例健康体检者作为对照，应用PCR-RFLP检测法检测大肠癌人群的外周血中亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因多态性情况，结果发现观察组中58例含GG基因型，26例含GA基因型，12例含AA基因型；而对照组中60例含GG基因型，32例含GA基因型，4例含AA基因型，MTHFD1 基因rs2236225 位点等位基因频率分布在大肠癌患者和健康受试者之间存在统计学差异（P<0.05）；计算观察组与对照组突变等位基因G相对于等位基因A（OR=1.603，95%CI=0.331～2.534，P<0.05），rs2236225基因型者大肠癌的发病风险增加1.6倍。

本研究结果显示：大肠癌组MTHFD1基因rs2236225基因型分布频率和等位基因频显著异于健康受试者，差异有统计学意义（P<0.05）；MTHFD1 基因rs2236225多态是导致大肠癌的易感性的主要因素，而G/A杂合子可以有效降低大肠癌的发病率，是大肠癌的重要保护因素。目前已有研究表明，可导致DNA的甲基化的唯一因素是T/T基因型患者叶酸摄入水平过低。但是，关于MTHFR基因多态导致大肠癌易感性降低的作用方式仍然有待于进一步分析研究[6，7]。

综上所述，MTHFD1基因多态性与大肠癌的易感性显著相关，这可能为大肠癌分子治疗提供依据。

[参考文献]

[1] Bijnsdorp IV，Kruyt FA，Fukushima M，et al. Molecular mechanism underlying the synergistic interaction between trifluorothymidine and the epidermal growth factor receptor inhibitor erlotinib in human colorectal cancer cell lines[J]. Cancer Sci，2010，101（2）：440-447.

[2] 张艳玲，苑晓燕，张冲，等. 胸苷酸合成酶基因及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与辽宁本溪人群结直肠癌易感性的关系研究[J]. 临床肿瘤学杂志，2008，13（9）：769-773.

[3] 朱凡，王敏明，张勤英. 血浆同型半胱氨酸、血清叶酸及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与结、直肠癌发病关系的研究[J]. 东南大学学报，2010，29（1）：88-92.

[4] 于兆亚，汤静. hOGG1基因多态性与胃癌遗传易感性的关系[J]. 中国医药科学，2013，3（20）：27-29.

[5] 沈晓波，池圣亮. 抑癌基因PTEN在大肠癌中的表达及临床意义[J]. 中国现代医生，2013，51（33）：53-54，57.

[6] 周丽娜，谭悦，徐燕，等. 结直肠癌易感性与CYP1A1基因多态性关系的Meta分析[J]. 肿瘤研究与临床，2013，25（8）：535-538.

[7] 孙静锋，张冬，闻鉴非，等. XRCC1R399Q基因多态性与结直肠癌易感性的Meta分析[J]. 中国肿瘤外科杂志，2013，5（2）：95-98.

（收稿日期：2014-05-19）