富硒辣木籽蛋白降压肽的酶法制备、硒含量及稳定性研究

陈冰冰 杨 奕 李嘉颐 金昶言 程缤霈 邓泳琪 林碧敏 梁 东 唐德剑 孟 莉 苗建银

(1. 华南农业大学食品学院广东省功能食品活性物重点实验室，广东 广州 510642；2. 省部共建药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室，广西 桂林 541004；3. 农业农村部富硒产品开发与质量控制重点实验室/富硒食品开发国家地方联合工程实验室，陕西 安康 725000；4. 安康市富硒产品研发中心，陕西 安康 725000)

全球高血压患者人数逐年增加，预计到2025年，发病人数将超过15亿[1-2]。降压肽又称血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽，主要通过降低ACE活性来降低血压，而ACE在肾素—血管紧张素系统中起着关键作用[3]。目前，ACE抑制剂是治疗高血压的主要药物，但临床上服用合成ACE抑制剂的患者存在不同程度的副作用，如头痛、疲劳、咳嗽、水肿、皮疹等[4-6]。而从蛋白质酶解产物中分离出的ACE抑制肽具有效果温和、专一、高效和无副作用等特点，具有良好的开发价值[7]。植物蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽因其成本低、安全性高、无毒副作用而成为研究热点，如从黑豆蛋白[8]、魔芋蛋白[9]、绿茶渣蛋白[2]、玉米蛋白[10]等酶解物中发现具有ACE抑制活性的多肽，并开发出了多种相关产品。

硒(Se)是人和动物的必需微量元素之一，参与硒酶和硒蛋白的形成，在调节氧化还原平衡、物质代谢、发育与生殖及免疫功能方面发挥重要作用[11]。此外，硒还具有抗氧化[12]、抗炎[13]、抗病毒[14]、提高机体免疫力[15]、预防心脑血管疾病[16]等生理功能。与无机硒相比，天然有机硒具有低毒性、生物利用率高和多种生理活性等优点，目前已从富硒大豆[17]、富硒大米[18]、富硒茶[19]中分离并鉴定出了含硒肽。

辣木(MoringaoleiferaLam.)是一种生长在热带和亚热带的药食两用植物[20-21]，其叶被中国绿色食品发展中心认定为“国家首推绿色食品”[22]，具有多种生理保健活性。研究发现，辣木籽是一种具有多种生理活性的天然原料，具有降糖尿病[23]、抗炎和缓解腹痛[24]等功能。研究拟以富硒辣木籽蛋白为原料，优化富硒辣木籽蛋白中具有ACE抑制活性肽的酶解制备工艺，并评价最优条件下降压肽的稳定性及硒含量，旨在为富硒辣木籽蛋白资源的利用和天然富硒降血压肽的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

富硒辣木籽蛋白粉：北部湾滨海富硒功能农业研究院；

碱性蛋白酶(20万U/g)、胃蛋白酶(300万U/g)、木瓜蛋白酶(20万U/g)、胰蛋白酶(25万U/g)：广西南宁庞博生物工程有限公司；

血管紧张素转化酶(ACE，来源于兔肺)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)：美国Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 主要仪器设备

数显恒温水浴锅：HH-4型，金坛市华城海龙实验仪器厂；

冷冻干燥机：FD-1型，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

pH计：PHS-3CW型，北京赛多利斯科学仪器有限公司；

电热恒温培养箱：DH5000BII型，天津泰斯特仪器有限公司；

台式低速自动平衡离心机：L530型：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

多功能酶标仪：2300型，美国PerkinElmer公司；

原子荧光光度计：AFS-9530型，北京海光仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 富硒辣木籽蛋白降压肽制备 称取一定量的富硒辣木籽蛋白粉，加入蒸馏水配制成一定浓度的蛋白质溶液，调节pH，加入一定量的酶，沸水浴灭酶，4 000 r/min离心20 min，收集上清液，测定ACE抑制率。

1.2.2 蛋白酶初筛 以富硒辣木籽蛋白为原料，选取4种蛋白酶在其最适条件下酶解，分别为碱性蛋白酶(pH 8.5，55 ℃)、胃蛋白酶(pH 2，37 ℃)、木瓜蛋白酶(pH 6.5，55 ℃)、胰蛋白酶(pH 8，37 ℃)。其余试验条件：底物浓度5%，酶底比0.3%，酶解时间3 h，灭酶，离心，取酶解液用蒸馏水稀释10倍，测定ACE抑制率，选择制备富硒辣木籽蛋白降压肽的最佳酶。

(1) 酶解时间：在最适蛋白酶的基础上，固定胰蛋白酶酶解温度37 ℃，pH 8，底物浓度5%，酶底比0.3%，考察酶解时间(1，2，3，4，5 h)对富硒辣木籽蛋白酶解物ACE抑制活性的影响。

(2) 酶解温度：在最适蛋白酶的基础上，固定胰蛋白酶酶解时间3 h，pH 8，底物浓度5%，酶底比0.3%，考察酶解温度(27，32，37，42，47 ℃)对富硒辣木籽蛋白酶解物ACE抑制活性的影响。

(3) pH：在最适蛋白酶的基础上，固定胰蛋白酶酶解时间3 h，酶解温度37 ℃，底物浓度5%，酶底比0.3%，考察pH(7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)对富硒辣木籽蛋白酶解物ACE抑制活性的影响。

(4) 底物浓度：在最适蛋白酶的基础上，固定胰蛋白酶酶解时间3 h，酶解温度37 ℃，pH 8，酶底比0.3%，考察底物浓度(1%，3%，5%，7%，9%)对富硒辣木籽蛋白酶解物ACE抑制活性的影响。

(5) 酶底比：在最适蛋白酶的基础上，固定胰蛋白酶酶解时间3 h，酶解温度37 ℃，pH 8，底物浓度5%，考察酶底比(0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%)对富硒辣木籽蛋白酶解物ACE抑制活性的影响。

1.2.4 响应面优化 基于单因素试验结果，以底物浓度、酶解温度和酶解时间为自变量，以ACE抑制率为响应值，根据Box-Behnken中心组合设计原理进行三因素三水平响应面试验，优化降压肽的最佳制备工艺。

1.2.5 最优酶解液的超滤分离 将最佳条件下获得的酶解液用10 kDa的超滤膜进行超滤，收集<10 kDa和>10 kDa组分冷冻干燥，密封保存备用。

1.2.6 ACE抑制率测定 根据文献[25]。

要进一步推进大学生的社会实践,建立完善的社会实践评价机制势在必行。在评价考核的时候,学校应该更加重视学生的实践成果，做好实践活动的评价反馈，使学生能明确自己的不足之处，并在之后的学习中不断完善自己。学校应加强与社会实践单位的沟通，与所在单位负责人进行时时联系,加强对学生社会实践的过程管理，以便切实了解学生的社会实践状况，从而进一步完善学校、学生和实践单位三者间的互动和沟通。

1.2.7 硒含量测定 按GB 5009.93—2017执行。

1.2.8 富硒辣木籽蛋白降压肽的稳定性分析 根据最优条件制备ACE抑制酶解液，冻干即得富硒辣木籽降压肽粗肽粉，配制质量浓度为5 mg/mL的多肽溶液，以ACE抑制率为指标，分别考察温度、pH及体外模拟胃肠道酶系对富硒辣木籽降压肽稳定性的影响。

(1) 温度：根据文献[26]。

(2) pH：根据文献[26]。

(3) 模拟胃肠道消化：根据文献[26-27]并修改。将富硒辣木籽蛋白降压肽用0.1 mol/L的HCl调节pH为2，加入质量分数为1%的胃蛋白酶，37 ℃水浴3 h，灭酶10 min，冷却，用1 mol/L的NaOH调节pH为7，4 000 r/min 离心10 min，测定上清液的ACE抑制率。取离心前pH为7的溶液，加入质量分数为1%的胰蛋白酶，37 ℃水浴3 h，灭酶10 min，4 000 r/min离心10 min，测定上清液的ACE抑制率。

1.2.9 数据处理 使用SPSS 21.0软件进行数据处理，字母不同表示在P<0.05范围内存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶初筛

由图1可知，4种蛋白酶的酶解效果分别为胰蛋白酶>碱性蛋白酶>木瓜蛋白酶>胃蛋白酶，且差异显著(P<0.05)。胰蛋白酶水解富硒辣木籽蛋白产物具有最高的ACE抑制率(68.86%)，其酶切位点优先在精氨酸和赖氨酸处裂解，C末端Arg或Lys的存在能增强ACE抑制活性[28-30]。因此，选择最佳酶为胰蛋白酶。

图1 蛋白酶种类对酶解物ACE抑制率的影响Figure 1 Effects of protease species on ACE inhibition rate of enzymatic hydrolysates

2.2 单因素试验

2.2.1 酶解时间对酶解效果的影响 由图2可知，当酶解时间<3 h时，ACE抑制率随酶解时间的增加而显著升高(P<0.05)；当酶解时间>3 h时，ACE抑制率有轻微下降，可能是由于酶解反应在3 h内持续进行，富硒辣木籽蛋白被不断水解，使得具有抑制ACE活性的肽不断积累，ACE抑制率则不断增强；进一步延长反应时间(>3 h)，富硒辣木籽的蛋白质底物被完全分解，而胰蛋白酶仍具有活性，会分解新生成的肽产物，导致活性肽含量降低，抑制活性降低。实际生产中，在不降低目标产物ACE抑制活性前提下，可以缩短酶解时间使生产效率最大化，故确定最佳酶解时间为3 h。

图2 时间对ACE抑制率的影响Figure 2 Effect of time on ACE inhibition rate

2.2.2 酶解温度对酶解效果的影响 由图3可知，随着催化酶解反应温度的不断升高，水解产物对ACE的抑制作用明显增加(P<0.05)，当反应温度为37 ℃时，ACE抑制率最大为66.88%。随着酶解温度的升高，胰蛋白酶的活性逐渐增大，与底物的接触几率增大，水解效率增加，ACE抑制活性也随之增加。但当酶解温度超过最适温度(37 ℃)后继续增高，过高的酶解温度可能导致胰蛋白酶变性失活，底物不能被有效地水解，降低了对底物水解后产物ACE的抑制效果[31-32]。故选择最佳酶解温度为37 ℃。

图3 酶解温度对ACE抑制率的影响Figure 3 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibition rate

2.2.3 pH对酶解效果的影响 由图4可知，ACE抑制率随酶解pH的增大先上升后下降，当pH为8时达最大值66.67%。pH值是影响酶解效果的重要因素，其影响体现在蛋白酶构象、酶与蛋白质的结合状态等方面，过高或过低的pH都不利于酶解[33-34]。pH 8是胰蛋白酶的最适pH值，此时酶活性最强，水解效率也最高，水解后的产物中含有更多的活性短肽，ACE抑制率高，但当pH低于或高于8时，胰蛋白酶活性下降，富硒辣木籽蛋白被胰蛋白酶催化水解效率下降，具有ACE抑制活性的短肽数目减少，ACE抑制率降低。故选择最佳pH为8。

图4 pH对ACE抑制率的影响Figure 4 Effect of pH on ACE inhibition rate

2.2.4 底物浓度对酶解效果的影响 由图5可知，当底物浓度为1%～5%时，ACE抑制率随底物浓度的增加而显著增加(P<0.05)，当底物浓度为7%时，ACE抑制率达最高值68.78%，可能是由于通过增加底物浓度来增加反应体系中底物与酶分子的碰撞机会，从而提高了酶解反应速度[35]。当底物浓度不断增加，抑制剂的效果反而降低，一方面可能是因为没有足够的酶催化底物反应，另一方面由于酶解液过于黏稠，影响蛋白质的自由扩散，影响酶解效率，从而影响抑制率[36]。故选取最佳底物浓度为7%。

图5 底物浓度对ACE抑制率的影响Figure 5 Effect of substrate concentration on ACE inhibition rate

2.2.5 酶底比对酶解效果的影响 由图6可知，ACE抑制率随酶底比的增加呈先增大后缓慢降低的趋势，当酶底比为0.1%～0.3%时，ACE抑制率显著增加(P<0.05)，且在0.3%达最大值68.85%。而后继续增大酶底比，ACE抑制率缓慢降低(P>0.05)，主要是因为酶底比较低时，与蛋白底物结合未完全达到一定的饱和，随着酶底比的增加，酶与底物结合越来越接近饱和，由于底物蛋白有限，过多的蛋白酶无法作用蛋白进行水解，因此，抑制率变化缓慢。此外，酶解物被水解后含有更多不具有ACE抑制活性的小肽片段，导致活性降低[37-38]。故选取最佳酶底比为0.3%。

图6 酶底比对ACE抑制率的影响Figure 6 Effect of enzyme/substrate on ACE inhibition rate

2.3 响应面优化

在单因素基础上，选取底物浓度、酶解温度和酶解时间3个因素为优化因素。响应面因素水平设计见表1，试验设计及结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

各因素经二次多项回归拟合后，得回归方程为：

Y=71.34+0.11A-2.45B-0.78C+0.89AB-1.56AC-1.34BC-2.52A2-2.30B2-3.86C2。

(1)

由表3可知，模型显著(P=0.012 4<0.05)，失拟项不显著，说明回归模型理想，可以用来拟合底物浓度、酶解温度和酶解时间3个因素对水解产物ACE抑制率的影响。一次项B和二次项C2对ACE抑制率影响极显著(P<0.01)，二次项A2和B2对ACE抑制率影响显著(P<0.05)。

表3 响应面二次模型方差分析†Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

由图7可知，各因素对酶解液ACE抑制率的影响为酶解温度>酶解时间>底物浓度。根据回归模型，得到最佳酶解工艺为底物浓度6.84%，酶解时间3.01 h，酶解温度34.25 ℃。考虑实际生产情况，将工艺调整为底物浓度7%，酶解时间3 h，酶解温度34 ℃，此条件下，酶解液ACE抑制率预测值为72.01%，实测值为71.34%，与理论值误差<1%，说明该模型获得的最佳酶解工艺是可靠的。

图7 各因素相互作用对ACE抑制率影响的响应面图Figure 7 Response surface diagram of the influence of each factor interaction on ACE inhibition rate

2.4 最优酶解物及超滤组分对ACE抑制活性的影响

由图8可知，在质量浓度范围内，ACE抑制率随质量浓度的增加显著上升(P<0.05)，当质量浓度为4 mg/mL时，ACE抑制率由高到低为分子量小于10 kDa组分(78.88%)>最优酶解物(67.00%)>分子量大于10 kDa组分(62.71%)，相应的IC50值分别为1.859，1.956，3.426 mg/mL，表明分子量小于10 kDa组分的ACE抑制率最高，显著高于最优酶解物和分子量大于10 kDa组分(P<0.05)。ACE抑制率随富硒辣木籽多肽分子量的降低而升高，与陈龙等[39-40]的结论一致。

图8 富硒辣木籽蛋白酶解物及超滤组分对 ACE的抑制率Figure 8 ACE inhibition rate of Se-enriched Moringa oleifera seed protein hydrolysates and ultrafiltration components

2.5 硒含量

试验发现，富硒辣木籽蛋白原料和富硒辣木籽降压肽中硒含量分别为1.269，1.394 mg/kg，表明富硒辣木籽蛋白经酶解筛选后硒被富集。刘恋等[41]测得恩施富硒大豆蛋白粉中硒含量为1.068 8 mg/kg，刘波等[42]测得富硒大米中硒含量为0.167 5 mg/kg。此外，富硒螺旋藻蛋白获得的硒肽具有较高的ACE抑制率[43-44]，且富硒大豆低聚肽的降血压作用主要是硒与肽的协同作用[17]。综上，富硒辣木籽蛋白是一种硒含量较高的植物蛋白资源，是富硒辣木籽蛋白肽的制备及分离纯化的优良天然富硒原料。

2.6 富硒辣木籽蛋白降压肽的稳定性

2.6.1 温度对辣木籽降压肽稳定性的影响 由图9可知，当温度为20～100 ℃时，降压肽的ACE抑制率为79.17%～84.85%，说明ACE抑制率在温度20～80 ℃时变化不显著(P>0.05)；当温度为100 ℃时，ACE抑制率为79.17%，相对于其他温度处理下显著降低(P<0.05)，但比例变化与其他温度处理下相比不超过6%。总体看来，ACE抑制活性受温度的影响较小，在一定范围内降压肽表现出良好的温度稳定性，与Hwang等[45]和王珊珊[46]的试验结果一致。

图9 富硒辣木籽ACE抑制肽的温度稳定性Figure 9 Temperature stability of ACE inhibitory peptides from Se-enriched Moringa oleifera seed

2.6.2 pH对辣木籽降压肽稳定性的影响 由图10可知，当pH为10时，ACE抑制率为83.91%，相对于pH 2～8时显著降低(P<0.05)，可能是因为降压肽在一定碱性环境下出现了快速消旋，改变了肽链结构，降低了多肽活性[47]，但与最高值相差≤6%。因此，pH对富硒辣木籽降压肽的ACE抑制活性存在一定影响，但幅度不大，降压肽在强酸或强碱条件下继续维持较完整的酶体结构及活性。这与Li等[8]和周剑敏等[26]的试验结果一致。

图10 富硒辣木籽ACE抑制肽的酸碱稳定性Figure 10 pH stability of ACE inhibitory peptides from Se-enriched Moringa oleifera seed

2.6.3 模拟胃肠道消化对辣木籽降压肽稳定性的影响

由图11可知，与未消化的降压肽相比，胃蛋白酶水解的降压肽和胃蛋白酶与胰蛋白酶共同作用的降压肽的抑制率未明显降低(P>0.05)，说明富硒辣木籽降压肽活性不受胃肠蛋白酶的影响，具有良好的体外消化稳定性，与Antonio等[48]和罗鹏等[49]的研究结论一致。

图11 富硒辣木籽ACE抑制肽的体外消化稳定性Figure 11 In vitro digestion stability of ACE inhibitory peptides from Se-enriched Moringa oleifera seed

3 结论

以富硒辣木籽蛋白粉为原料，以血管紧张素转化酶抑制率为指标，优化了富硒辣木籽蛋白降压肽的酶解工艺，并分析了酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性、硒含量和稳定性。结果表明，富硒辣木籽蛋白降压肽的最佳酶解工艺为酶解时间3 h，酶解温度34 ℃，pH 8，底物浓度7%，酶底比0.3%。该条件下制备的血管紧张素转化酶抑制肽的硒含量是辣木籽蛋白原料的1.1倍。此外，该降压肽还具有良好的温度、酸碱和体外胃肠道消化稳定性。后续将对富硒辣木籽肽进行纯化鉴定、体内外活性评价、构效关系研究等，以明确其降血压作用机制。