大豆分离蛋白及卡拉胶对泥鳅肌原纤维蛋白凝胶特性的影响

孙朋朋 王 薇 李若彤 朱 红 任圆圆

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

泥鳅，又称鳅鱼，是中国极具特色的淡水鱼类，有“水中人参”之美誉[1]。据《中国渔业统计年鉴》[2-4]显示，2013—2017年泥鳅的养殖量分别为32.15万，34.31万，36.62万，37.26万，39.47万t，以平均每年5.7%的速度持续增加。但泥鳅等淡水鱼与海水鱼相比，其鱼糜的凝胶性能相对较差，因此其深加工程度较低，目前以鲜活销售为主。

肌原纤维蛋白是一类具有重要生物学功能的结构蛋白，因其出色的水结合能力和凝胶形成能力，决定着鱼糜制品的保水性、质构等品质特性。在肌原纤维蛋白的热诱导凝胶化过程中，肌原纤维蛋白内部结构遭到破坏而发生伸展，蛋白质分子之间相互聚集，形成高黏弹性的三维网络凝胶结构，这种结构对鱼糜制品的品质特性非常重要[5]。目前国内外针对肌原纤维蛋白改性的研究较多，包括物理改性、化学改性、生物改性以及新型技术的改性等[6]。此外，利用肌原纤维蛋白和高分子化合物(如：多糖、蛋白质等)形成复合物也是提高其凝胶特性的方法之一。吕旭琴等[7]探讨了不同种类多糖对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响，包括阴/阳离子多糖、中性多糖及改性多糖。Lin等[8]探究了植物蛋白混合物对红鲷鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响。

大豆分离蛋白与卡拉胶是常用的凝胶改良剂，常被用于鱼糜凝胶制品的食品加工中，以提升产品的凝胶性、持水性以及肉制品的口感。然而，目前关于使用大豆分离蛋白和卡拉胶对泥鳅肌原纤维蛋白进行改性的研究尚未见报道。研究拟以泥鳅肌原纤维蛋白为研究对象，探究大豆分离蛋白及卡拉胶对其凝胶特性的影响，以期为开发泥鳅类鱼糜制品提供理论参考，提高泥鳅的经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

鲜活泥鳅：市售；

大豆分离蛋白、卡拉胶：北京索莱宝科技有限公司；

所有分析用有机溶剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

紫外可见分光光度计：UV-2600型，日本岛津公司；

质构仪：TMS-PRO型，美国Food Technology Corporation (FTC)公司；

色差仪：Hunterlab型，昆山蕴科机电科技有限公司；

扫描电子显微镜：Tescan Vega 3型，捷克泰斯肯(Tescan)公司；

红外光谱仪：VECTOR22型，德国BRUKER公司。

1.2 方法

1.2.1 泥鳅肌原纤维蛋白的提取 参考Pan等[9]的方法并加以改进。将鲜活泥鳅去头、尾、内脏、鱼皮及骨刺后，清洗沥干，获得泥鳅肉。向其中加入事先预冷(4 ℃)的0.02 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(含0.01 mol/L Na2HPO4·12H2O、0.01 mol/L NaH2PO4·2H2O、0.1 mol/L Triton-X 100)[m泥鳅肉∶V缓冲溶液=1∶4 (g/mL)]，高速匀浆，在4 ℃、9 982 r/min条件下离心15 min收集沉淀，重复上述步骤两次。向所得沉淀中加入事先预冷(4 ℃)的0.1 mol/L NaCl溶液[m泥鳅肉∶VNaCl溶液=1∶4 (g/mL)]，高速匀浆，双层纱布过滤。所得滤液在4 ℃、9 982 r/min条件下离心15 min 收集沉淀，重复上述步骤两次，最终得到的沉淀即为泥鳅肌原纤维蛋白(MP)，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 凝胶的制备 用0.6 mol/L NaCl溶液将MP质量浓度调节至70 mg/mL，分别加入0%，1%，2%，3%，4%，5%的大豆分离蛋白及卡拉胶(以MP含量计)，混匀，40 ℃加热60 min，90 ℃加热30 min，立即取出冷却至室温，置于4 ℃冰箱中平衡过夜，得到复合物凝胶。

1.2.3 凝胶强度的测定 将凝胶切成大小均匀一致的圆柱状(Φ30 mm×10 mm)，利用质构仪对其凝胶强度进行测定。使用P/0.5型号圆柱探头，设定探头位移速度为0.5 mm/s，初始高度为11 mm，下压比例30%，触发力0.1 N。

1.2.4 保水性的测定 采用离心法测定凝胶的保水性。准备一根干燥洁净的离心管，取一定质量的凝胶放入离心管中，在4 ℃、9 982 r/min条件下离心10 min，倾倒上清液，用滤纸吸干凝胶表面水分，再次称量离心后凝胶与离心管的质量。按式(1)计算凝胶的保水性(Water Holding Capacity，WHC)。

(1)

式中：

WHC——保水性，%；

W——离心管的质量，g；

W1——离心管与初始凝胶的质量，g；

W2——离心管与离心后凝胶的质量，g。

1.2.5 蒸煮损失的测定 取一定质量的凝胶样品，在40 ℃条件下加热1 h，再转入90 ℃加热30 min 后取出，冷却至室温，擦干表面水分后再次称量凝胶的质量。按式(2)计算凝胶的蒸煮损失(Cooking Loss，CL)。

(2)

式中：

CL——蒸煮损失，%；

M1——凝胶的初始质量，g；

M2——蒸煮后凝胶的质量，g。

1.2.6 白度的测定 将凝胶切成10 mm厚的圆片，利用色差仪测定其表面的色差(L*，a*，b*)，测前先用标准白板进行校正。按式(3)计算凝胶的白度(Whiteness，W)。

(3)

式中：

W——白度；

L*——亮度值；

a*——红度值；

b*——黄度值。

1.2.7 微观结构测定 将凝胶切成3 mm×3 mm×3 mm的块状，在2.5%的戊二醛溶液中固定过夜，然后用0.2 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液清洗3次，再依次用30%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇溶液梯度脱水，每次脱水30 min。最后经真空冷冻干燥(真空度为1 Pa，冷阱温度为-70 ℃，运行时间为24 h)及喷金处理后，用扫描电子显微镜进行微观结构的观察[10]。

1.2.8 傅里叶红外光谱的测定 将真空冷冻干燥后的凝胶与KBr以m凝胶∶mKBr为1∶150进行混合研磨，压成薄片，利用傅立叶红外光谱仪对其进行扫描。扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为16次。使用MONIC软件对数据进行去卷积，PeakFit 软件对1 700～1 600 cm-1区域进行二阶导数峰值拟合[11]。

1.3 数据处理与统计分析

所有试验均进行3次重复，并采用Microsoft Excel计算平均值及标准偏差，SPSS 23.0软件中的Duncan 法进行显著性分析，Origin 2019软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 凝胶强度

由图1可知，随着大豆分离蛋白含量的增加(1%～5%)，MP凝胶硬度呈先降低后升高的趋势，而凝胶弹性整体上则先升高后降低。当大豆分离蛋白含量为1%时，MP凝胶硬度最大(1.95 N)，比对照组增加81.39%(P<0.05)，而MP凝胶弹性最小，比对照组减小10.63%(P<0.05)；添加3%的大豆分离蛋白，MP凝胶硬度最低(1.5 N)，但仍显著高于对照组(P<0.05)，此时的凝胶弹性最大。这可能是由于大豆分离蛋白本身具有较好的乳化性能，可使单位体积凝胶分子数量增加，促进分子间相互作用[12]。与大豆分离蛋白不同，不同含量(1%～5%)的卡拉胶对MP凝胶硬度和弹性均有减弱作用。当卡拉胶含量为1%时，MP凝胶弹性较好，但仍低于对照组(P<0.05)；当卡拉胶含量为2%和4%时，MP凝胶硬度低达0.3 N，比对照组降低了72.09%。作为一种凝胶多糖，卡拉胶具有优良的凝胶特性，可与蛋白质络合提升产品质量。但试验中，卡拉胶并未提高泥鳅肌原纤维蛋白的凝胶品质，与孙泽坤等[13]的研究结果相反。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图1 大豆分离蛋白及卡拉胶对泥鳅肌原纤维蛋白凝胶硬度和弹性的影响Figure 1 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel hardness and springiness of myofibrillar protein from loach

2.2 凝胶保水性

由图2可知，低含量(1%)的大豆分离蛋白不利于MP凝胶保水性，而高含量(≥2%)的大豆分离蛋白可以提高其保水性。当大豆分离蛋白含量为4%时，MP凝胶保水性高达88.97%，比对照组提高了6.67%(P<0.05)。这可能是由于大豆分离蛋白可以为周围水分子提供更多的氢键结合位点，增强氢键和二硫键[14-15]，使蛋白质交联程度增大。张钰嘉等[16]也发现大豆分离蛋白可以提高草鱼肌原纤维蛋白凝胶的保水能力。与大豆分离蛋白不同，卡拉胶的添加对MP凝胶保水性的影响没有一定规律。当卡拉胶含量为2%，4%时，MP凝胶保水性低于对照组，而在其他添加量时则高于对照组。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 大豆分离蛋白及卡拉胶对泥鳅肌原纤维蛋白凝胶保水性的影响Figure 2 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel water holding capacity of myofibrillar protein from loach

2.3 凝胶蒸煮损失

由图3可知，随着大豆分离蛋白和卡拉胶含量(1%～5%)的增加，MP凝胶蒸煮损失呈先降低后升高的趋势，且均低于对照组，表明这两种添加物都可以不同程度地降低MP凝胶的蒸煮损失率。这可能是由于在加热过程中，大豆分离蛋白、卡拉胶及肌原纤维蛋白的结构被充分打开，分子间相互作用增强，使得凝胶网络持水能力增强，从而减少蒸煮损失率[17]。值得注意的是，添加相同含量(≤4%)的大豆分离蛋白及卡拉胶，后者的MP凝胶蒸煮损失均较小，说明卡拉胶对MP凝胶蒸煮损失的降低效果比大豆分离蛋白的好。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 大豆分离蛋白及卡拉胶对泥鳅肌原纤维蛋白凝胶蒸煮损失的影响Figure 3 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel cooking loss of myofibrillar protein from loach

2.4 凝胶白度

由图4可知，与对照组相比，不同含量(1%～5%)的大豆分离蛋白对MP凝胶白度均有一定的降低作用(P<0.05)，而卡拉胶对MP凝胶白度整体上呈增大作用。当卡拉胶含量为5%时，MP凝胶白度最大，较对照组增加3.77%(P<0.05)。这主要是因为大豆分离蛋白外观呈暗黄色，而卡拉胶为白色粉末，因而大豆分离蛋白的添加会降低整个体系的白度，而卡拉胶则与之相反。赵泽润等[12]在研究大豆分离蛋白对低盐木质化鸡肉糜凝胶特性的影响时也得到类似结论。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图4 大豆分离蛋白及卡拉胶对泥鳅肌原纤维蛋白凝胶白度的影响Figure 4 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel whiteness of myofibrillar protein from loach

2.5 凝胶微观结构

由图5可知，对照组MP凝胶为不均匀的、疏松的网络结构，这是由于肌原纤维蛋白受热而变性展开，又因降温时的聚合作用相互交联形成。随着大豆分离蛋白含量的增加，MP凝胶出现较多孔洞，且孔径越来越大。当大豆分离蛋白含量≥4%时，疏松的网络结构明显变得更加紧实，可能是由于大豆分离蛋白填充到肌原纤维蛋白凝胶的微观空隙中造成的。由于大分子的填充以及蛋白质分子间的相互作用使得复合凝胶的硬度增大，但网络结构趋向于刚性结构，造成弹性下降[18]。研究[19]表明，肌原纤维蛋白凝胶微观结构与其保水性有关，若凝胶网络均匀致密，则凝胶保水性高。这与试验结果相吻合。与大豆分离蛋白不同，添加1%的卡拉胶后，MP凝胶由疏松多孔的结构变为层次分明的网络状；随着卡拉胶添加量的继续增加，MP凝胶又出现规则有序的凝胶网络结构。

图5 大豆分离蛋白及卡拉胶对泥鳅肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响Figure 5 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel microstructure of myofibrillar protein from loach

2.6 凝胶二级结构

蛋白质的红外光谱特征谱带主要由酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带组成。利用PeakFit软件对酰胺Ⅰ带进行基线校正、去卷积和峰拟合，然后根据各拟合峰位置及峰面积可以对泥鳅肌原纤维蛋白凝胶二级结构的相对含量进行分析。由图6(a)可知，与对照组相比，添加大豆分离蛋白后，肌原纤维蛋白凝胶中β-折叠结构有所下降，仅在添加量为3%时略高于对照组；无规则卷曲及a-螺旋结构相对含量均低于对照组，而转角结构则较对照组显著增加。这可能是由于大豆分离蛋白与肌原纤维蛋白复合物在形成凝胶的过程中产生了共价相互作用，促使肌原纤维蛋白的a-螺旋展开，形成更多的转角结构[20]。也有可能是因为大豆分离蛋白与肌原纤维蛋白是非共价结合，而大豆分离蛋白本身作为一种蛋白质，对肌原纤维蛋白的二级结构测定结果产生了一定的影响[21]。

图6 大豆分离蛋白及卡拉胶对泥鳅肌原纤维蛋白凝胶二级结构的影响Figure 6 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel secondary structure of myofibrillar protein from loach

与大豆分离蛋白不同，卡拉胶的添加使肌原纤维蛋白凝胶中无规则卷曲结构消失，β-折叠结构大幅度上升，表明更多的蛋白质分子之间靠氢键发生交联，蛋白质三维网络结构变得更加有序[22]，见图6(b)。但a-螺旋及转角结构的相对含量呈不规律的变化，在添加量为1%，3%，5%时两者的相对含量都增加，其余添加量时则相反，说明凝胶的质地性质不仅仅与肌原纤维的β-折叠结构有关，可能还取决于其a-螺旋和转角结构。梁恽红等[23]认为，蛋白质中a-螺旋向有序的β-折叠转化时，更有利于形成规则有序的凝胶网络结构。因此，推测凝胶网络的有序性与β-折叠的数量呈正相关，与卡拉胶对泥鳅肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响结果一致。

3 结论

利用大豆分离蛋白和卡拉胶对泥鳅肌原纤维蛋白进行改性，采用质构仪、色差仪、扫描电镜和红外光谱等探究其对泥鳅肌原纤维蛋白凝胶特性的影响。结果显示，随着大豆分离蛋白含量的增加，泥鳅肌原纤维蛋白凝胶硬度先降低后升高，弹性先升高后降低，保水性增加，蒸煮损失降低，凝胶网络孔洞越来越大，各二级结构相对含量发生变化；而卡拉胶对凝胶硬度和弹性有减弱作用，对白度及蒸煮损失有较好的改善作用，凝胶网络结构规则有序且无规则卷曲结构消失。