灰树花功效成分及其生物活性研究进展

2022-09-15熊雯宇何君强戴婉真吴毓彦

食品与机械 2022年8期

熊雯宇何君强戴婉真吴毓彦刘斌,2

(1. 福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2. 国家菌草工程技术研究中心，福建福州 350002)

灰树花(Grifolafrondosa)呈珊瑚状重叠成簇，富有特殊的浓郁香气，兼具药食两用价值[1]。研究[2]表明，灰树花中含有多糖、甾体、多酚、生物碱、三萜、皂苷、有机酸、维生素、矿物质等功效成分，这些成分使得灰树花具有抗肿瘤、增强免疫、抗病毒、降血糖及调节肠道菌群等[3]生物功能。目前已有以灰树花为原料的口服液、养生面、调味料等功能食品[4-5]。研究拟对灰树花主要功效成分分离纯化及其生物活性作用的研究现状进行综述，总结灰树花功效成分在抗肿瘤、抗病毒、降血糖、调节肠道菌群等方面的研究，并指出当前灰树花相关研究中存在的问题和未来研究方向，以期为灰树花资源加工及深度开发提供理论依据。

1 灰树花主要功效成分

1.1 多糖类

灰树花多糖是一种天然的高分子聚合物，通常与蛋白质结合在一起。研究[6]表明，灰树花多糖具有潜在的辅助抗肿瘤、抗氧化、降血糖、增强免疫力及保护肝损伤等作用。热水提取、碱提取、酶解提取、微波提取、超声提取等是目前常见的灰树花粗多糖提取法。提取的粗多糖通常采用乙醇分级沉淀、透析、超滤膜分级、硅胶柱层析、凝胶柱层析等方法进行分离纯化，再进一步除去蛋白质、色素和其他小分子杂质。在不同条件下提取纯化的多糖，其结构和功效通常也是不同的(见表1)。Nanba等[16]通过热水提取、乙醇沉淀、去除酸溶性组分、去蛋白等纯化试验，从灰树花多糖中分离纯化出碱溶性的D组分，这是一种具有1→3支链的β-1,6-葡聚糖，后续对D组分进一步纯化得到MD组分，其分子结构是含β-1,3和β-1,6糖苷键的β-葡聚糖。Kubo等[17]对热水提取的灰树花粗多糖进行分级醇沉，在50%乙醇沉淀中分离得到X组分(m粗多糖∶m蛋白为65∶35)。此外，Ma等[18]用30 kDa 和50 kDa的超滤膜将灰树花多糖按照分子量大小进行分离，得到以葡萄糖苷为主的EXO-GFO多糖组分，经凝胶层析柱CL-4B柱和离子柱CL-6B进行分离纯化得到E组分[19]，其相对分子质量约为2×106，蛋白含量0.6%，是含β-1,3-支链的β-1, 6-葡聚糖。Xu等[20]利用Sephadex G-100凝胶柱从灰树花中分离得到由吡喃糖苷组成的杂多糖，该组分中m半乳糖∶m甘露糖∶m葡萄糖为6.5∶1.0∶2.6。

采用不同的提取和分离纯化方法来降低提取温度和缩短提取时间及细化多糖分子量，可以提高多糖的稳定性以保持其完整结构和生物活性。对灰树花多糖结构的研究大多停留在对其多糖的分子量、摩尔比、单糖组成、糖残基组成、连接方式等一级结构分析。由于多糖结构的复杂性，完全解析多糖结构难度较大，需要同时使用多种方法，这也是后续研究中所需攻克的难题。

1.2 甾体类

甾体是天然产物中十分常见的化学成分，多以游离状态存在，还可以高级脂肪酸或者糖苷的形式存在。此外，甾体因具有抗氧化、抗炎等生物活性而被用于生产甾体药物和维生素D3[21]。Zhang等[22]将灰树花发酵菌丝体用正己烷提取后，通过甲醇重结晶的方式得到麦角甾醇，再通过薄层色谱和以三氯甲烷—甲醇体系作为流动相的硅胶柱进行分离纯化，得到麦角甾醇-4,6,8(14),22-四烯-3-酮，并且通过GC-MS分析正己烷—乙醚体系柱层析得到的组分是由1-油酰-2-亚油酰-3-棕榈酸甘油酯组成。庞菲[23]按照极性分段并逐级缩小有活性的物质的范围，通过硅胶柱层析和微量重结晶的方法从灰树花醇提物萃取后的乙酸乙酯层中分离纯化出3种物质，并用核磁共振技术鉴定其结构，分别为麦角甾醇，5α,8β-过氧麦角甾-6,22E-二烯-3β-醇，3β,5α,6β-三羟基麦角甾醇。Chen等[24]将灰树花乙醇提取物通过大孔吸附树脂柱洗脱，再用甲醇—水体系的硅胶柱分离，通过半制备液相色谱分离纯化并鉴定得到9种麦角甾醇及其衍生物。

综上，灰树花甾体化合物的分离纯化常采用有机溶剂萃取法、薄层色谱法、柱层析及重结晶法。随着科技的进步，制备型高效液相色谱的应用使化合物的纯度获得了很大的提升，分离纯化效率也能得到极大的提高。但是，近年来关于灰树花甾体化合物的研究多集中于分离纯化和结构鉴定方面，而对于生物活性的研究较少，进一步明确灰树花甾体的生理作用是今后研究的重点。

1.3 多酚类

研究[24]表明，多酚类化合物不仅有抗氧化、抗肿瘤、防治冠心病、预防骨质疏松作用还有抗菌、抗炎及抑制结肠癌等作用。目前国内外对多酚类物质的研究报道大多集中在果蔬、茶叶及其他食药用菌中。陈向东等[25]和柴丽[26]均证明灰树花菌丝体水体上清液的粗提物中主要组成成分为多酚类物质，对其抗氧化、抗菌等活性进行研究，结果表明粗提物无明显抑菌效果。吕旭聪等[27]通过LC-MS从灰树花40%乙醇提取物中鉴定出2-羟基丁二酸、香豆酸、3-羟基白藜芦醇、白藜芦醇、二羟基苯乙酸、咖啡酸和4-羟基苯甲酸共7个多酚类成分。李燕[28]从灰树花乙酸乙酯提取物中鉴定出野靛黄素和矢车菊素-3-O-芸香糖苷，分别属于异黄酮类和花氰苷类。

表2总结了灰树花中多酚类化合物的种类、提取方法、分离纯化方法及其生物活性。目前大多数研究还停留在粗多酚的提取工艺优化层面，但粗提物含有较多杂质，影响后续生物活性效果的研究。探索从天然产物中提取纯度高、活性强的天然多酚类化合物，并进一步研究其与人类健康的关系将成为新的研究热点，为开发天然药物奠定基础。

1.4 多肽类

多肽通常由蛋白经过酶解得到，是一种重要的营养素，对食品的物理特性具有重要意义。功能多肽是具有特定氨基酸序列、单一结构、作用机理明确的小分子化合物，在美白、抗氧化、抗菌、抗皱抗衰老、促进毛发生长等方面有较高的生物活性。据报道现已开发出具有抗冻[29]、抗氧化[30]、降血压[31]等活性的多肽(见表3)，因此，活性多肽在保健品方面有良好的应用前景。许锐[32]将分子量200～3 000 Da超滤膜截留的灰树花复合酶解物进行凝胶色谱分离，后经过反相液相制备色谱分离纯化呈味肽，采用UPLC-Q-TOF/MS测定出呈味肽的氨基酸序列为RSGV和YHGPF，结果发现两种肽的浓度与鲜味和浓厚感均有正相关性。陈贵堂等[33]通过碱溶酸沉法提取灰树花蛋白，以碱性蛋白酶可控酶解制备灰树花抗氧化肽，证实了美拉德反应是提高灰树花多肽DPPH自由基清除率的有效方法。

表3 活性多肽的提取方法及应用前景Table 3 Extraction methods and application prospects of active polypeptides

对灰树花多肽的研究大多集中在制备方法和生物功能方面，对多肽的结构研究相对较少。随着科技的发展和分析检测技术的进步，对灰树花多肽结构与活性的研究将不断深入，为人类健康作出更多的贡献。

1.5 其他类

近年来，灰树花的基础营养成分已经被广泛研究。但对灰树花生物活性的研究以多糖为主，对其他小分子化合物分离鉴定及生物活性的研究报道较少。庞菲[23]的试验结果表明灰树花化学成分可能含有香豆素、有机酸、生物碱、甾体、黄酮、三萜、皂苷类化合物。马迪等[34]通过硅胶柱层析和重结晶等方式从灰树花醇提物中分离纯化得到12种物质，除已知的麦角甾醇、葡萄糖以外，还得到脑苷脂、1-十七醇、正二十八烷、烟酸、琥珀酸、甘露醇、烟酰胺、尿嘧啶、腺苷以及尿苷等多种化学成分。Chen等[24]通过大孔吸附树脂、制备型液相从灰树花95%乙醇提取物中分离出20种化合物，包括8种吡咯生物碱、2种酰胺、1种维生素化合物和9种麦角甾醇衍生物。此外，在灰树花活性物质的研究中，对其结构与生物活性的构效关系、有效剂量等尚不明确。近年来国内外学者对天然产物及其生物活性的研究热情将会加速对灰树花功效成分的研究。

2 灰树花功效成分的生物活性作用

2.1 抗肿瘤

灰树花功效成分的抗肿瘤活性作用已经得到了广泛的研究并取得一定的成效[35-36]。其抗肿瘤机理为灰树花功效成分可通过清除自由基，激活免疫系统，诱导肿瘤细胞凋亡等方式来抑制肿瘤细胞生长。灰树花多糖抗肿瘤效果已经被多项研究证实，Roldan-Deamicis等[37]研究发现经腹腔注射5.0 mg/kg灰树花多糖D组分的BALBc小鼠乳腺癌预防率达到64%以上，这是因为D组分可通过下调SPARC基因的mRNA表达水平来预防乳腺癌，因此灰树花多糖D组分可一定程度上抑制乳腺肿瘤细胞的生长。Alonso等[38]也证明了灰树花多糖的D组分能够直接作用于乳腺肿瘤细胞，减少乳腺肿瘤细胞的迁移并抑制其生长。灰树花多糖GP11在体外对HepG-2细胞间接地起到抗细胞毒素作用，在体内可能通过TLR-4信号通路刺激NO、TNF-α和IL-1β的上调来改善免疫系统功能，从而发挥其抗肿瘤活性[39]。庞菲[23]对麦角甾醇及其衍生物抗肿瘤细胞增殖的抑制作用进行了研究，证实其对MCF-7细胞有抑制作用。综上，灰树花多糖、甾体等功效成分可以通过增强免疫系统、抗细胞毒性以及抑制心血管增生等途径从而直接或间接地抑制肿瘤生长。

2.2 增强免疫

Borchers等[40]发现灰树花核酸提取液使小鼠胸腺重量从50.00 mg升高至72.15 mg，腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞率增加了2%左右，外周血T淋巴细胞数也提升了10%。因此，灰树花中的核酸有促进机体新陈代谢，提高免疫力的作用。李小定等[41]发现灰树花多糖能显著增加荷瘤小鼠的胸腺指数、脾细胞抗体形成能力及淋巴细胞转化能力等参数，并且灰树花多糖含量越高，其增强免疫能力越显著。同样，Li等[42]研究表明灰树花多糖GFP-22可改善或逆转CTX诱导的免疫抑制，使机体脾细胞、胸腺指数、脾淋巴细胞、细胞因子明显增加。大量研究[6]发现，灰树花多糖能极大地激活细胞免疫功能，通过介导 MAPK/NF-κB通路，刺激巨噬细胞释放细胞因子，增强机体免疫力。综上，灰树花核酸和多糖类化合物可通过调节免疫因子和免疫细胞来发挥免疫调节作用。

2.3 降血糖

灰树花降血糖作用主要体现在抑制糖脂代谢引起的氧化应激反应，改善细胞受损状态，缓解炎性反应[43]等方面。灰树花多糖能直接与胰岛素受体结合，增加胰岛素的敏感性及糖尿病小鼠的糖耐受性。灰树花经提取、分离纯化后得到两个具有降血糖活性的多糖组分GFP-N和GFP-W，二者可通过IRS/PI3K通路改善细胞胰岛素水平，促进葡萄糖吸收，还可介导肠道菌群达到改善小鼠2型糖尿病的目的[44]。雷红等[45]证实灰树花多糖可以延缓葡萄糖在糖尿病机体肠道内的吸收，抑制α-葡萄糖苷酶活性，从而降低血糖水平，同时增强机体的糖耐受性。Pan等[46]发现灌喂GF95(灰树花95%乙醇提取物)后的糖尿病大鼠AMPK-α和CYP7A1的mRNA表达增加，而SREBP-1c、FAS、IL1β和ACC的mRNA表达降低，证实了GF95对降低血脂、肝脏指数和总胆汁酸均有积极作用，因此，可以通过激活AMPK相关信号通路来改善饮食诱导的小鼠肥胖和胰岛素抵抗。综上，灰树花中的功效成分主要通过调节相关因子水平、相关酶水平来抑制机体体重的减少、恢复其血糖血脂、逆转其肝组织损伤、提高胰岛素水平、提高短链脂肪酸丰度及改善肠道菌群结构，从而调节机体糖脂代谢紊乱。

2.4 抗病毒

现今化学抗病毒药物的毒副作用大且病毒对现有药物的抗药性强，所以需要开发安全性高的天然药物。项哨等[47]研究表明灰树花多糖具有显著抗病毒作用，推测其可能是通过提高机体免疫力达到抗病毒目的。据报道[48]，灰树花的MD组分通过增强巨噬细胞、细胞毒性T细胞或辅助T细胞等免疫感受性细胞的活性，直接杀死HIV病毒或抑制其增殖。高路营[49]和Zhao等[50]通过体外细胞试验证实灰树花多糖能够有效地抑制EV71病毒的RNA和结构蛋白VP1的合成，从而抑制病毒的复制。综上，灰树花多糖能够有效干扰病毒复制，通过提高机体免疫力而减轻病毒引起的炎症和抑制病毒的传播。往后可以对灰树花其他功效成分抗病毒作用展开更深入的研究。

2.5 调节肠道菌群

许多学者[44,46,51]认为灰树花功效成分通过调控肠道菌群中菌种结构组成与微生物代谢产物，从而维持肠道微生态平衡。有研究[52]表明，多糖、黄酮、脂肪酸等功效成分进入机体后，黄酮、脂肪酸等小分子活性物质可直接被肠道吸收，而多糖等大分子物质进入肠道后与肠道菌群相互作用，代谢成小分子物质再经肠肝轴循环被吸收后发挥活性作用。Pan等[46]发现机体摄入GF95后脂质代谢异常大鼠肠道中的有益菌数量增加，而这些有益菌可以将肠道中的碳水化合物转为重要的微生物代谢物丁酸和异丁酸。Guo等[53]发现灰树花多糖通过改变肠道菌群和调节肝脏糖脂代谢相关基因降低糖尿病小鼠的血糖和血脂，从而成为潜在预防高血糖高血脂的功能性食品成分。Chen等[44]研究表明灰树花多糖可作为改善糖尿病的增强剂和调节糖尿病机体肠道菌群的功能食品。

综上，灰树花功效成分有调节肠道菌群进而改善代谢型疾病的作用。但灰树花功效成分介导肠道菌群发挥作用机制尚不明确，后续需进行更加系统而深入的研究。

2.6 其他作用

除了上述作用外，灰树花还具有多种生物活性作用。Klaus等[54]发现灰树花多糖和热碱提取物具有较高的抗菌、抗氧化和体外抗肿瘤潜力。Zhang等[55]发现灰树花可通过提高衰老小鼠体内SOD和T-AOC活性，降低MDA含量，使大脑损伤和恶化明显减轻，表明灰树花具有良好的抗氧化和抗衰老活性。Meng等[51]发现灰树花多糖可以抑制丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的活性，提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，从而使机体肝损伤状态有所改善。此外，灰树花还具有抗辐射作用，汪维云[56]研究表明灰树花多糖可以保护受辐射小鼠的造血组织，提高骨髓的DNA含量。Xu等[20]研究表明灰树花多糖通过降低半胱天冬酶mRNA的表达，促进皮肤抗老化作用。目前，大多数灰树花生物活性的确切分子作用机制尚未明确，后续需进行深入研究。灰树花功效成分的生物活性作用机制如图1所示。