高效液相色谱法测定牛羊组织中碘醚柳胺残留量

王丽娜，田晓玲，刘鸿鹤，李欣南，郭国贤，兰雨濛，刘 颖

(辽宁省检验检测认证中心，沈阳 110016)

碘醚柳胺(C19H11Cl2I2NO3，CAS:22662-39-1，结构式见图1)是一种广谱抗蠕虫药，是控制牛羊肝片吸虫、大片吸虫成虫和幼虫病的高效药物，对血毛线虫、巨片吸虫和羊蝇蛆亦有较好作用。肝片吸虫是一种人畜共患的食源性寄生虫，主要寄生于哺乳动物的胆道内。人感染后可引起肝脏损害和出血，可造成胆管阻塞、肝实质变性、黄疸等。分泌毒素具有溶血作用，且肝片吸虫病的诊断较困难，往往在作出诊断之前已经造成巨大经济损失，对社会、畜牧业和人类健康带来巨大威胁。对于此病的防治，主要靠抗肝片吸虫药物碘醚柳胺进行治疗，在欧洲、澳大利亚及南美等国家和地区已作为牛羊片形吸虫病的首选药物，被广泛用于家禽、猪、牛等的饲料添加剂和兽药中预防动物疾病、促进动物生长[1-6]。食品安全国家标准GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中规定碘醚柳胺在牛的肌肉、脂肪、肝和肾中最大残留限量分别为30、30、10、40 μg/kg，在羊的肌肉、脂肪、肝和肾中最大残留限量分别为100、250、150、150 μg/kg[7]。碘醚柳胺残留检测的主要方法为利用经典的液-液分配样品前处理、固相萃取去除杂质[8]，高效液相色谱法[9-13]或液相色谱-串联质谱法进行检测[14-15]。截至目前我国尚无检测牛羊组织中碘醚柳胺残留量的检测标准，国内外相关文献也较少，主要集中在药物剂型的研究和毒性研究，为了加强动物性食品中碘醚柳胺的残留监控，按农业部《农业部关于下达2011年农业行业标准制定和修订项目资金的通知》(农财发[2011]53号，任务编号为201113054)要求，制定了碘醚柳胺在牛羊组织中残留检测的液相色谱法，并对该方法的线性、检测限、定量限、回收率等方面进行了系统研究。本方法针对牛、羊的肌肉、脂肪、肝、肾组织，建立高效液相色谱检测方法，从而为该类药物的残留监控提供科学依据。

图1 碘醚柳胺结构式Fig 1 Structural formula of rafoxanidum

1 材料与方法

1.1 仪器与材料 waters2695高效液相色谱仪(配备荧光检测器，美国Waters公司)；高速冷冻离心机(Biofuge Strators Centrifuge，德国Thermo Fisher Scientific公司)；均质器(PRO250,美国Pro Scientific 公司)；氮吹仪(OA-SYS，美国Organomation Associates.Inc 公司)；MilliQ超纯水器(美国Millipore公司)；碘醚柳胺对照品(纯度99.0%)、乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)、氨水(分析纯)、高氯酸(分析纯)、Waters MAX固相萃取小柱(150 mg/6 mL)。牛羊组织空白试料来源于辽宁省现代农业生产基地建设工程中心。

1.2 标准溶液的配制 精密称取10 mg碘醚柳胺标准品，置100 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀。-20 ℃保存，用乙腈稀释成浓度为1 μg/mL对照品中间液。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：C18(4.6 mm×250 mm，粒径5 μm)；流动相：乙腈+0.1%甲酸溶液(85+15，V/V)；流速：1.0/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；配荧光检测器(激发波长335 nm；发射波长510 nm)。

1.3.2 样品溶液的制备

1.3.2.1 提取 称取试料5 g(精确至±1%)于50 mL离心管中，加乙腈-丙酮溶液(80+20)15 mL，涡旋1 min，10000 r/min离心5 min，移取上清液。残渣再用10 mL乙腈-丙酮溶液(80+20)重复提取一次，合并上清液。

1.3.2.2 净化 固相萃取柱用乙腈-丙酮溶液(80+20)活化，加上清液，过柱。依次用乙酸乙酯5 mL、乙腈5 mL淋洗小柱，挤干。用1%甲酸乙腈溶液5 mL洗脱，收集。洗脱液于40 ℃水浴中氮气吹干。准确加乙腈1 mL溶解残渣，过0.45 μm滤膜，供高效液相色谱测定。

2 结果与分析

2.1 方法专属性考察 对照品溶液色谱图见图2。取空白牛羊组织样品，按1.3.2项操作，得图3。在上述条件下，样品杂质无干扰，专属性良好。

图2 对照品溶液色谱图Fig 2 chromatogram of the standards

图3 空白牛羊组织色谱图Fig 3 chromatogram of blank tissue of sheep and cattle

2.2 线性范围 分别精密量取适量10 μg/mL的碘醚柳胺储备液，制得浓度为10、50、100、500、1000和5000 ng/mL系列对照溶液，上机测定。以峰面积为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，得到标准曲线y=898506x-8675.1，相关系数r=0.9999。

2.3 检测限与定量限的确定 空白试料按1.3.2项的步骤处理后，测定结果表明：在相应的保留时间，空白试料对所测分析物无干扰。

检测限(LOD)与定量限(LOQ)：添加适量混合标准溶液于5 g空白样品中，制成不同浓度的阳性样品。每个浓度5平行，重复3次。按1.3.2项操作经提取净化后上机测定，观察药物信噪比(S/N)和对应药物浓度。以S/N>3(按PtP算)作为方法检测限，S/N>10(按PtP算)作为方法定量限。得出碘醚柳胺在牛羊肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中的检测限均为2.5 μg/kg，定量限均为5 μg/kg。各组织定量限回收率及精密度见表1～表8。

表1 空白羊肉中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab 1 Results of recovery experiments and RSD in mutton(n=5)

表2 空白牛肉中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab 2 Results of recovery experiments and RSD in beef(n=5)

表3 空白羊肝中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab 3 Results of recovery experiments and RSD in sheep liver(n=5)

表4 空白牛肝中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab 4 Results of recovery experiments and RSD in cattle liver(n=5)

表5 空白羊肾中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab 5 Results of recovery experiments and RSD in sheep kidney(n=5)

表6 空白牛肾中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab 6 Results of recovery experiments and RSD in cattle kidney(n=5)

表7 空白牛脂肪中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab 7 Results of recovery experiments and RSD in cattle fat(n=5)

表8 空白羊脂肪中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab 8 Results of recovery experiments and RSD in sheep fat(n=5)

2.4 方法的精密度 按1.3.2项操作，根据食品安全国家标准GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[7]中规定碘醚柳胺在牛和羊的肌肉、脂肪、肝和肾中最大残留限量(MRL)分别制备低(1/2MRL)、中(MRL)、高(2MRL)三个浓度水平的质量控制(QC)样品，每一浓度进行5样本分析，重复3次。根据当日的标准曲线，进行样品的浓度测定，求批内、批间相对标准偏差，计算结果见表1～表8。结果表明，空白肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中15～500 ng/g添加浓度范围内的回收率为77.4%～93.8%，批内批间RSD值均<15%。

2.5 回收率试验 按1.3.2项操作，制备低(1/2MRL)、中(MRL)、高(2MRL)三个浓度水平的质量控制(QC)样品，每一浓度进行5样本分析，根据当日的标准曲线，进行样品的浓度测定。结果表明，空白肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中15～500 ng/g添加浓度范围内的回收率为77.4%～93.8%，具体结果见表1～表8。

3 讨论与小结

3.1 分析条件的优化 碘醚柳胺在丙酮中溶解，在氯仿或乙酸乙酯中略溶，在甲醇中微溶，在水中不溶[16-17]。通过大量查阅国内外文献，实验中最先参考已经报道的1%三乙胺乙腈[9]，磷酸-柠檬酸缓冲液[10]，乙腈[12]作为提取溶剂，结果发现，上述三种提取液对于肾脏和脂肪提取回收率小于60%，且图谱中干扰物质较多，说明该方法不适用于基质复杂的肝脏和脂肪，为了提高回收率，选择乙腈-丙酮作为萃取溶剂，兼顾了丙酮的溶解性和乙腈的沉淀组织蛋白能力，获得较好的提取效果，并有效去除了组织中蛋白质等杂质干扰。本文比较了乙腈和丙酮溶液不同比例的提取效果，结果表明当乙腈-丙酮溶液体积比为80∶20时提取效果最佳，回收率最高，杂质干扰最少。

MAX固相萃取柱(150 mg/6 mL)的填料是一种反相和阴离子交换复合模式“水可浸润型”聚合物吸附剂。该基质洁净，在pH 0～14范围内都稳定，在有机溶剂中稳定，比表面积高，交换容量大，对酸性化合物具有高度的选择性和灵敏度。本研究对比了HLB、C18、MAX固相萃取小柱，对添加回收率考察和杂质干扰进行分析，结果表明HLB固相萃取柱回收率低于 C18和MAX固相萃取柱。进一步比较了C18和MAX固相萃取柱的净化效果，结果发现C18固相萃取柱对于肝脏和脂肪的净化效果差，杂质干扰多，而MAX固相萃取柱对牛羊组织均有较好的净化效果。

3.2 流动相的选择 参照文献[9-10,12]，对比了乙腈-0.02 mol/L乙酸铵、甲醇、乙腈∶水(85∶15),乙腈+0.1%甲酸水(85+15)。结果显示，上述四种流动相，只有乙腈+0.1%甲酸水(85+15)能够将对照品与牛羊所有组织杂质完全分开，且无干扰。

3.3 检测波长的选择 参照文献[9-13,15-17]，发现碘醚柳胺检测大多选择选择紫外检测器，由于牛羊组织中基质复杂，含有大量的脂肪和蛋白质，待测物质容易受到干扰，影响色谱分离。为了降低杂质的干扰，本文选择荧光检测器，荧光检测器专属性强，选择性好，灵敏度高，且只对荧光物质有响应，能够有效降低基质干扰，提升检测灵敏度。应用荧光检测器进行波长扫描，结果显示碘醚柳胺在激发波长335 nm；发射波长510 nm处，杂质干扰小，响应值最大。

本试验建立的样品前处理分析方法净化效果好，回收率高，专属性强、灵敏度高，测得碘醚柳胺在肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中的检测限均为2.5 μg/kg，定量限均为5 μg/kg，回收率在77.4%～93.8%之间，适用于牛羊组织中碘醚柳胺残留量检测。