2017-2021年上海市动物源粪肠球菌、屎肠球菌耐药性情况变迁分析

张 妤,孙冰清,姜 芹,顾 欣,吴雨珊,张文刚,商 军

(上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103)

肠球菌(Enterococcus)属于革兰氏阳性球菌，广泛存在于土壤、植物以及人类和动物胃肠道中，是人类及动物肠道中常见菌群之一，也是条件致病菌，可引起人及动物多种疾病[1-2]。肠球菌具有坚厚的细胞壁，对头孢菌素、氨基糖苷类等多种抗菌药物天然耐药，同时它可通过质粒、转座子、整合子-基因盒系统等方式从其他细菌获取耐药基因，从而产生获得性耐药[3]。肠球菌属中较为常见的是粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和屎肠球菌(EnterococcusFaecium)[4]。粪肠球菌常被报道为致病性或潜在致病性细菌的耐药基因贮藏库[5]。同时，肠球菌引起的感染病例中，屎肠球菌的感染比例呈现出上升趋势[6]。中国细菌耐药监测网统计显示，医院临床病例中分离得到的肠球菌多重耐药现象十分严重[7]。耐药肠球菌的产生增加了临床抗感染工作的难度，也逐渐成为一个重要的公共卫生问题。由于动物源肠球菌的耐药基因存在着可能通过养殖环节、屠宰环节及食物链等多种途径传播的风险，因此，对人类健康造成潜在威胁，给养殖业也带来风险。为了解近年来上海市动物源肠球菌耐药情况及MIC(minimal inhibitory concentration)变迁情况，拟选择猪、鸡、牛养殖场为研究对象，对常见10种抗菌药物的耐药性进行监测与分析，并计算得到MIC50与MIC90。MIC为最小抑制病原微生物生长的药物浓度，相对应的MIC50和MIC90分别指抑制50%和90%病原微生物生长的抑菌浓度，常用于衡量抗菌药物抵抗病原微生物的能力[8]。因此，开展动物源粪肠球菌、屎肠球菌耐药性监测，可了解上海地区动物源肠球菌耐药性本底情况，为抗菌药物使用的风险评估提供基础数据。通过比较五年间MIC50和MIC90的变迁情况，可掌握本市粪肠球菌及屎肠球菌对不同药物的耐药发展趋势，对遏制肠球菌耐药、保障公共卫生安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 458株粪肠球菌及283株屎肠球菌，分离自2017～2021年自上海地区21家养殖场(2家牛场、7家鸡场、12家猪场)的猪/牛肛门、鸡泄殖腔拭子，冻存于-80 ℃冰箱。粪肠球菌标准菌株ATCC 29212(美国菌种保藏中心)。

1.1.2 试剂与仪器 胰酪大豆胨琼脂培养基(tryptose soya agar,TSA)、阳离子调节MH肉汤(cationadjusted Mueller-Hinton broth,CAMHB)(青岛海博公司)；0.9%生理盐水(121 ℃高压灭菌30 min)；冻干型革兰氏阳性菌药敏板，内含庆大霉素(gentamicin,GM)、阿莫西林/克拉维酸(amoxicillin,AMC)、青霉素(penicillin,P)、头孢西丁(cefoxitin,FOX)、头孢噻呋(ceftiofur,XNL)、氧氟沙星(ofloxacin,OFX)、恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)、氟苯尼考(florfenicol,FFC)、万古霉素(vancomycin,VA)、利奈唑胺(linezolid,LNZ)等10种抗菌药物(复兴诊断科技(上海)有限公司)；比浊仪、Sensititre AIM全自动菌液接种仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 肠球菌抗菌药物敏感性测试 将冻存的肠球菌接种至TSA上，36 ℃培养18 h，挑取2～3个新鲜培养的单菌落，置于3 mL灭菌生理盐水中，使用比浊仪将细菌浓度调整至0.48～0.52麦氏单位，含菌量约为1 × 108CFU/mL，随后使用CAMHB进行200倍稀释，接种于含不同药物浓度的96 孔冻干型细菌药敏板中，每孔100 μL，置于36 ℃培养箱中培养18 h，分别设置阳性对照孔(加入待测菌液)、阴性孔(加入无菌CAMHB)。同时使用粪肠球菌ATCC 29212进行药敏测定作为质控。

1.2.2 结果判读 自培养箱中取出药敏板，置于衬有黑底板的光线下肉眼观察结果。依据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的相应标准对抗菌药物敏感性结果进行判读，判读标准如表1所示。S(Susceptible)是指细菌对抗菌药敏感，当MIC值小于表1中抗菌药物临床折点判断标准所示值时，则判为S；R(Resistance)是指细菌对某种抗菌药耐药, 当MIC值大于表1中抗菌药物临床折点判断标准所示值时，则判为R;I(Intermediate)是指细菌对抗菌药中度敏感，当MIC值为表1中抗菌药物临床折点判断标准所示区间或者不为S或R时，则判为I[9]。药敏板上阴性对照孔内应无细菌生长，液体未见浑浊；阳性对照孔内有细菌生长，液体浑浊，且质控菌株的 MIC 值在规定的范围内，则药敏板结果有效。

表1 肠球菌对常见抗菌药物的折点判断标准和质控菌株MIC范围Tab 1 Break point criteria of Enteroccus against common antibiotics and MIC range of quality control strains

2 结果与分析

2.1 肠球菌耐药率比较 结果显示，粪肠球菌及屎肠球菌均对头孢西丁(99.6%，95.4%)、氧氟沙星(93.0%，59.8%)及头孢噻呋(89.3%，65.4%)的较为耐药；对青霉素(4.8%，10.6%)、阿莫西林/克拉维酸(0.4%，2.8%) 较为敏感；未分离到耐万古霉素的肠球菌。两种肠球菌对氟苯尼考(59.8%，24.2%)、庆大霉素(56.1%，12.0%)、利奈唑胺(48.3%，4.9%)、恩诺沙星(33.2%，17.3%)的耐药率存在较大差异，且粪肠球菌比屎肠球菌更为耐药。动物源粪肠球菌及屎肠球菌对10种抗菌药物的耐药率结果见图1所示。

图1 粪肠球菌及屎肠球菌对10种抗菌药物的耐药率Fig 1 The resistance rates of E.faecalis and E.faecium to 10 kinds of antibiotics

2.2 肠球菌MIC变迁情况

2.2.1 β-内酰胺类抗菌药物 2017-2021年β-内酰胺类药物对粪肠球菌的MIC值见表2、表3。五年间，头孢噻呋MIC50保持在32 μg/mL，MIC90在2017年有所上升后，近年来呈下降趋势；阿莫西林/克拉维酸MIC502017年由2 μg/mL下降至0.5 μg/mL后均保持在该水平，同时MIC90呈下降趋势，由16 μg/mL下降至1 μg/mL。

表2 2017-2021年头孢噻呋及阿莫西林/克拉维酸对粪肠球菌MIC值(μg/mL)Tab 2 MIC values of ceftiofur and amoxicillin/ clavulanate potassium against E.faecalis (μg/mL)

表3 2017-2021年青霉素及头孢西丁对粪肠球菌MIC值(μg/mL)Tab 3 MIC values of penicillin and cefoxitin against E.faecalis (μg/mL)

青霉素、苯唑西林、头孢西丁对粪肠球菌的MIC值均较为稳定，其中青霉素MIC50保持在4 μg/mL，MIC90虽比2017、2018年有所上升，但整体仍保持在4 μg/mL；粪肠球菌对苯唑西林及头孢西丁有较高耐药，五年间，苯唑西林MIC50及MIC90均为≥4 ug/mL，苯唑西林MIC50及MIC90均为≥128 μg/mL。

2017-2021年β-内酰胺类药物对屎肠球菌的MIC值见表4、表5。五年间，青霉素、阿莫西林/克拉维素的MIC50均较为稳定，MIC90均呈下降趋势，其中青霉素MIC50保持在4～8 μg/mL，MIC90由256 μg/mL下降至4 μg/mL；阿莫西林/克拉维酸MIC50保持在0.25～0.5 μg/mL，MIC90由64 μg/mL下降至1 μg/mL。

表4 2017-2021年青霉素及阿莫西林/克拉维酸对屎肠球菌MIC值(μg/mL)Tab 4 MIC values of penicillin and amoxicillin/clavulanate potassium against E.faecium (μg/mL)

表5 2017-2021年头孢噻呋及头孢西丁对屎肠球菌MIC值(μg/mL)Tab 5 MIC values of ceftiofur and cefoxitin against E.faecium (μg/mL)

苯唑西林对屎肠球菌的MIC值较为稳定，MIC50及MIC90均保持在大于4 μg/mL；而头孢噻呋及头孢西丁的耐药性变化趋势较为相似，其中头孢噻呋的MIC50于2018年下降至4 μg/mL，2019年有所上升，2021年下降至32 μg/mL，MIC902018年下降至128 μg/mL后又再次回升至256 μg/mL；头孢西丁MIC50于2019年有所上升，后由32 μg/mL下降至16 μg/mL，MIC90由大于128 μg/mL下降至32 μg/mL。

2.2.2 氟喹诺酮类抗菌药物 2017-2021年氟喹诺酮类药物对粪肠球菌的MIC值见表6。五年间，恩诺沙星的MIC50处于较低水平保持在1～2 μg/mL，MIC90则保持在大于64 μg/mL；氧氟沙星的MIC50由16 μg/mL降为4 μg/mL，MIC90于2020年由256 μg/mL降为64 μg/mL。

表6 2017-2021年恩诺沙星及氧氟沙星对粪肠球菌MIC值(μg/mL)Tab 6 MIC values of enrofloxacin and ofloxacin against E.faecalis (μg/mL)

2017-2021年氟喹诺酮类药物对屎肠球菌的MIC值见表7。五年间，恩诺沙星及氧氟沙星的MIC50均处于较低水平，恩诺沙星保持在0.5～2 μg/mL，氧氟沙星保持在2～4 μg/mL；MIC90均于2017年有所上升，恩诺沙星上升至64 μg/mL，氧氟沙星上升至256 μg/mL，两者近年来均处于下降趋势，恩诺沙星为波动下降，2021年降为4 μg/mL，氧氟沙星于2017年上升至256 μg/mL，后下降至8 μg/mL保持至今。

表7 2017-2021年恩诺沙星及氧氟沙星对屎肠球菌MIC值(μg/mL)Tab 7 MIC values of enrofloxacin and ofloxacin against E.faecium (μg/mL)

2.2.3 氨基糖苷类、氯霉素类、糖肽类、唑烷酮类抗菌药物 2017-2021年庆大霉素、氟苯尼考、利奈唑胺及万古霉素对粪肠球菌的MIC值见表8。五年间，庆大霉素的MIC50为上升趋势，MIC90均保持在大于2048 μg/mL；氟苯尼考MIC50保持在32～64 μg/mL，MIC90为下降趋势，由128 μg/mL下降至64 μg/mL；利奈唑胺的MIC50保持在4～8 μg/mL，MIC90保持在8 μg/mL；万古霉素的MIC50和MIC90五年来均较为稳定，期间略有浮动，MIC50保持在1 μg/mL， MIC90保持在2 μg/mL。

表8 2017-2021年庆大霉素、氟苯尼考、利奈唑胺及万古霉素对粪肠球菌MIC值(μg/mL)Tab 8 MIC values of gentamicin, florfenicol, linezolid and vancomycin against E.faecalis (μg/mL)

2017-2021年庆大霉素、氟苯尼考、利奈唑胺及万古霉素对屎肠球菌的MIC值见表9。五年间，庆大霉素的MIC50为下降趋势，由8 μg/mL下降至4 μg/mL，MIC90于2018年上升至512 μg/mL，近年来为波动下降，2021年下降至8 μg/mL；氯霉素类抗菌药物氟苯尼考MIC50及MIC90均为下降趋势，MIC50由64 μg/mL下降至2 μg/mL，MIC90由128 μg/mL下降至4 μg/mL；利奈唑胺的MIC50保持在2 μg/mL，MIC90由8 μg/mL降为2 μg/mL；万古霉素的MIC50和MIC90五年来均较为稳定， MIC50保持在0.5～ 1 μg/mL， MIC90保持在1～2 μg/mL。

3 分析与讨论

肠球菌是人与动物肠道正常的栖息菌，近年来逐渐证实具有致病能力，临床上可引起严重的感染和疾病，如心内膜炎、菌血症、泌尿系统等，也可感染鸡、鸭、猪、牛、羊、水产品等多种食品动物，导致疾病发生[10-14]。动物源肠球菌的耐药基因可通过养殖环境、食物链等传递给人。此外，有研究表明，耐药肠球菌的耐药基因可在质粒等移动元件介导水平传播给其他病原菌，给人类健康和公共卫生带来威胁[15]。

3.1 肠球菌耐药性比较 整体看来，上海地区动物源粪肠球菌耐药性比屎肠球菌更为严重。粪肠球菌和屎肠球菌均对β-内酰胺类抗菌药物中的头孢类药物有高耐药率(65%～99%)，这可能与肠球菌对头孢类药物具有固有耐药性有关[16],这也与河南地区李金磊等[17]、东北地区李延山等[18]的结果一致；两者对青霉素、阿莫西林/克拉维酸敏感，耐药率较低(均低于15%)，与东北地区李延山等[18]的结果一致，但四川地区张国明等[19]、宁夏地区王文等[20]的研究均显示肠球菌对青霉素均较为耐药(均高于50%)，这可能与养殖场用药有关，说明肠球菌的耐药情况存在着地域差异；根据喹诺酮类药物的耐药结果，两者均对氧氟沙星更为耐药(58%～93%)，对恩诺沙星更为敏感(17%～34%)，与新疆地区陈万昭等[21]的研究结果一致；根据氨基糖苷类及氯霉素类药物的耐药结果，粪肠球菌更为耐药，对庆大霉素(56.1%)及氟苯尼考(59.8%)的耐药率均高于屎肠球菌(庆大霉素12.0%，氟苯尼考24.2%)。

值得注意的是，粪肠球菌对利奈唑胺的耐药率为48.3%，屎肠球菌为4.9%。利奈唑胺是治疗由多重耐药革兰氏阳性菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)引起严重感染的重要药物[22]，而养殖场治疗用药中并无利奈唑胺。由于利奈唑胺是一种细菌蛋白质合成抑制剂，抑制蛋白质合成的初始阶段，不影响翻译起始tRNA的形成、延伸与终止阶段，和以往抗菌药物抑制蛋白合成的作用方式不同[23]，因此,利奈唑胺与其他抗菌药物不易发生交叉耐药，在体外也不易诱导细菌产生耐药[24]。故造成上海地区动物源粪肠球菌利奈唑胺较高耐药率的原因可能有二：一是其自身发生了23S rRNA V区突变，此突变为最主要的耐药机制，且粪肠球菌比屎肠球菌更容易被诱导突变[25]；二是耐药基因发生转移，如氯霉素-氟甲砜霉素耐药(cfr)基因(可能来自于耐氟苯尼考的菌株)、cfr(B)基因及optrA基因，该类耐药多通过外源性质粒介导[24]。研究表明，动物源肠球菌很可能作为耐药基因的贮存库，成为crf、cfr(B)、optrA基因等耐药基因的潜在来源，通过耐药基因的克隆扩增或水平转移在环境中传播[26-27]。本研究未发现耐万古霉素肠球菌(VRE)，但仍应严格控制药物的使用，避免交叉耐药，防止VRE的出现。

随着养殖业的快速发展，开展动物源性食品的耐药性风险评估势在必行，耐药率本底情况为耐药性风险评估计算中不可或缺的一部分[28]，本研究结果为细菌耐药性风险评估提供了数据支撑。

3.2 肠球菌MIC变迁分析 根据MIC变迁结果，2017～2021年上海地区动物源粪肠球菌对阿莫西林/克拉维酸、氧氟沙星的MIC50及MIC90均呈下降趋势；庆大霉素的MIC50为上升趋势，MIC90五年来无明显改变，但肠球菌对氨基糖苷类药物具有天然耐药性[29-30]，美国临床和实验室标准化协会(CLSI) 建议将肠球菌在氨基糖苷类药物上的耐药程度分为中度耐药和高度耐药，庆大霉素为目前已知的高水平耐药[31]；对利奈唑胺耐药率较高，但其MIC50及MIC90五年来无明显改变，MIC90为8 μg/mL,非高浓度抗菌药物耐药；对其余6种抗菌药物的MIC50和MIC90五年来无明显改变，其中，对青霉素、万古霉素均保持敏感。2017～2021年上海地区动物源屎肠球菌对阿莫西林/克拉维酸、头孢西丁及氟苯尼考的MIC50及MIC90均呈下降趋势；青霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、利奈唑胺的MIC50五年来无明显改变，MIC90呈下降趋势，说明高浓度耐药菌数量有所下降；对其余4种抗菌药物的MIC50和MIC90五年来无明显改变，其中庆大霉素、头孢噻呋MIC90均处于较高水平耐药，万古霉素处于敏感。

上海地区动物源肠球菌除对阿莫西林/克拉维酸、青霉素、万古霉素较为敏感之外，对多种抗菌药物均有较高的耐药率，不同肠球菌属细菌对同一抗菌药物存在不同程度的耐药现象。五年间，肠球菌对头孢西丁、青霉素、阿莫西林/克拉维酸、恩诺沙星、氧氟沙星及利奈唑胺存在不同程度耐药性下降趋势，耐药情况有好转趋势,除对庆大霉素、头孢噻呋有天然耐药性外[29-30]，其余3种抗菌药物MIC变迁无明显改变，耐药性无下降趋势。因此仍需进一步加强对抗菌药物的规范使用及动物源肠球菌的耐药性监测，在进行治疗用药时，应根据不同肠球菌属合理选择抗菌药物，合理轮换用药，进一步遏制动物源细菌耐药性的产生。

上海地区动物源肠球菌对多种抗菌药物具有不同程度的耐药，粪肠球菌耐药性整体高于屎肠球菌。五年来，整体耐药情况有好转趋势，仍需继续加强肠球菌耐药性监测。