HPLC法同时测定和评价“黔中金荞麦”中4种成分含量

陶小艳，张 涛，周思旋，向清华，唐远江，赵 宇，卢昱希，史开志

(贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵阳 550004)

金荞麦[Fagopyrumdibotrys(D. Don) Hara] 属于蓼科荞麦属植物，收录于《中华人民共和国药典》、《中华人民共和国兽药典》和《饲料药物添加剂允许使用品种目录》以及《饲料原料目录》中，其野生品种为国家Ⅱ级重点保护植物[1]，既可作为药物使用，又可作为饲料以及饲料添加剂使用，适用范围广，应用价值高。药用部位块状根茎具有清热解毒、排脓消肿清肺排痰等功效，归肺经，对呼吸系统疾病有一定疗效，现代药理研究表明，金荞麦具有抗菌消炎、解热镇痛、抗过敏、增强免疫等作用[2～3]。为了保护和利用好野生金荞麦这一优质植物资源，贵州省畜牧兽医研究所以贵州黔中地区野生金荞麦作为亲本，栽培驯化而成牧草新品种“黔中金荞麦”，其先后通过省级和国家级牧草品种审定。经选育的“黔中金荞麦”适应性较强、营养价值高、抗病虫害性强、耐刈割利用、易繁殖，高蛋白低纤维利于消化，是饲养猪、鸡、等畜禽喜食的优质青饲牧草[4～5]。艾蓉等以“黔中金荞麦”替代部分精粮饲喂猪和鸡，发现可降低养殖成本、提高经济收益[6]。邓蓉等评价“黔中金荞麦”的种草养畜社会生态效益，发现“黔中金荞麦”的种植不仅可以提高种植经济效益，还可提高土壤肥力、改善水土流失[7]。现已广泛种植并应用于贵州省六盘水、大方、黔西、威宁、息烽等10余个县(市)的生态畜牧养殖，取得了一定成效[8]。

金荞麦中的化学成分多以酚酸类、黄酮类和萜类为主，发挥的作用也多是这些化合物。“黔中金荞麦”作为药饲兼用、绿色环保的优质牧草，化学成分也比较丰富，但金荞麦在中国药典中的含量测定标准是表儿茶素(C15H14O6)，评价指标太过单一，无法全面来评价金荞麦的质量，因此,本试验以大中小极性的黄酮类物质及物质总和为指标来综合评价 “黔中金荞麦”的质量，采用高效液相色谱法同时测定“黔中金荞麦”与野生金荞麦中表儿茶素、原花青素B2、芦丁和槲皮素4种成分的含量，旨在建立一种简便快捷、准确可靠的质控方法，以及分析“黔中金荞麦”与野生金荞麦在这4种成分含量上的差异，有效控制药材的内在质量，充分保障其药用价值。此试验试验亦可为“黔中金荞麦”作为药用资源选育、饲料添加剂开发以及用于临床治疗提供科学依据。

1 试验材料

1.1 试验药材 2020 年于贵州省畜牧兽医研究所麦坪试验基地分别选择种源、栽培环境和管理条件一致的1～3年生及不同季节栽培地采集“黔中金荞麦”块根样品共5份；从麦坪试验基地迁至黔西种植的“黔中金荞麦”块根样品1份；在龙里、丹寨、普安、关岭和罗甸等收集野生金荞麦块根共5份，采自石柱(重庆)和云南的野生金荞麦块根样品共2份，总计13份样品。

1.2 试验仪器与耗材 LC-20A高效液相色谱仪(SIL-20A 自动进样器，SPD-20A 检测器，日本岛津公司)；C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本GL Sciences公司)；电子天平(A-R1140，瑞士梅特勒-托利多上海有限公司公司)；旋转蒸发仪(N-1300，上海爱朗仪器有限公司)；恒温数字显示水浴锅(HH-6，科密仪器仪表有限公司)；超声波清洗机(JT-410HT，深圳市洁拓超声波清洗设备有限公司)；0.45 μm微孔滤膜(岛津(上海)实验器材有限公司)；聚酰胺(30-60目，国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 试验试剂与药品 无水乙醇(分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，德国默克公司)；磷酸(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)；表儿茶素、原花青素B2和芦丁标准品(编号：C100865、C100664和C100001，贵州迪大科技有限公司)，槲皮素标准品(批号：ALT600928，天津阿尔塔科技有限公司)。

2 试验方法

2.1 标准品溶液制备 精密称量原花青素B2标准品0.0100 g、表儿茶素标准品0.0100 g、芦丁标准品0.0100 g、槲皮素标准品0.0100 g，分别加适量色谱甲醇于10 mL的容量瓶中，超声溶解后定容，得各标准品溶液母液，备用。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取干燥、粉碎后的药材2.00 g于烧瓶中，加80%乙醇40 mL，浸泡过夜，加热回流提取2 h，过滤后取全部滤液于水浴锅上挥干，加色谱甲醇溶解后转移至10 mL的容量瓶中，定容，离心取上清液5 mL过聚酰胺柱，先用50 mL的蒸馏水洗脱，弃掉水洗液，再用150 mL的无水乙醇洗脱，浓缩醇洗液，溶解、转移、定容至10 mL的容量瓶中，得供试品溶液，进样前摇匀，并用0.45 μm的微孔滤膜过滤，备用。

2.3 色谱条件 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈(A)-0.4%磷酸水(B)梯度洗脱，进样量10 μL，检测波长254 nm，温度30 ℃。梯度洗脱见表1。

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表1 梯度洗脱条件Tab 1 Procedore of gradient elution

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系考察 取适量原花青素B2、表儿茶素、芦丁和槲皮素标准品溶液母液，分别配置成5、25、45、65、85 μg/mL的浓度梯度溶液， 5、10、20、40、80 μg/mL的浓度梯度溶液， 0.5、1、2、4、8 μg/mL的浓度梯度溶液， 0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL的浓度梯度溶液，按2.3项下色谱条件进样，记录色谱图，测定原花青素B2、表儿茶素、芦丁和槲皮素的峰面积，绘制标准曲线。

2.4.2 精密度考察 精密吸取含原花青素B2100 μg/mL、表儿茶素100 μg/mL、芦丁100 μg/mL、槲皮素100 μg/mL的混合对照品溶液10 μL，按2.3项下色谱条件进样测定，重复6次，记录色谱图，测定峰面积，计算其RSD值。

2.4.3 重复性考察 精密称“黔中金荞麦”(黔西)的干燥粉末6份，每份约2.00 g，按照2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.3项下色谱条件进样测定，记录色谱图，测定原花青素B2、表儿茶素、芦丁和槲皮素的峰面积，计算其RSD值。

2.4.4 稳定性考察 精密吸取“黔中金荞麦”(黔西)制成的供试品溶液10 μL，在室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12 h按2.3项色谱条件进样测定，记录色谱图，测定原花青素B2、表儿茶素、芦丁和槲皮素的峰面积，计算其RSD值。

2.4.5 回收率测试 采用加样回收法，精密称取6份已知含量的黔中金荞麦(黔西产)约1 g，分别精密加入混合对照品20 mL(用色谱甲醇配置成的含原花青素B234 μg/mL、表儿茶素18.75 μg/mL、芦丁3.45 μg/mL、槲皮素0.85 μg/mL)，按2.2项方法提取制备供试品，按2.3项色谱条件测定，计算其峰面积。

2.4.6 样品测试 取测试试验药材按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.3项下色谱条件进样测定，记录色谱图，测定原花青素B2、表儿茶素、芦丁和槲皮素的峰面积，根据各对照品标准曲线计算样品含量。

3 结果与分析

3.1 线性关系考察 以标准品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制各对照品的标准曲线，各对照品标准曲线如下：原花青素B2：y=1922.3x-192.8(r2=0.9998)；表儿茶素：y=2190.3x-119(r2=0.9998)；芦丁：y=22572x+652(r2=0.9996)；槲皮素：y=33687x-89.8(r2=0.9999)。

3.2 精密度考察 原花青素B2、表儿茶素、芦丁、槲皮素峰面积的RSD分别为0.14%、0.10%、0.09%、0.07%(n=6)，表明所用仪器精密度良好。

3.3 重复性考察 原花青素B2、表儿茶素、芦丁、槲皮素峰面积的RSD分别为0.83%、1.09%、0.74%、1.50%(n=6)，表明该方法重复性良好。

3.4 稳定性考察 原花青素B2、表儿茶素、芦丁、槲皮素峰面积的RSD分别为0.88%、0.80%、1.62%、1.28%(n=6)，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

3.5 回收率试验 加样回收试验结果显示：原花青素B2、表儿茶素、芦丁和槲皮素的平均回收率分别为98.37%、98.68%、96.11%和97.56%，RSD分别为1.02%、1.00%、1.18%和1.01%。以上结果表明此方法检测“黔中金荞麦”中原花青素B2、表儿茶素、芦丁和槲皮素的含量可靠、稳定。加样回收率测试结果见表2。

表2 加样回收试验(n=6)Tab 2 Sample recovery test(n=6)

3.6 样品测试 以2.3项下的色谱条件对混合标准品及各供试品进行色谱测定，色谱图如图1所示。

1-原花青素B2，2-表儿茶素，3-芦丁，4-槲皮素

3.6.1 “黔中金荞麦”与不同产地野生金荞麦的成分含量 对采自贵州省内不同产地及云南、重庆的野生金荞麦与“黔中金荞麦”1年生根茎供试品溶液按照2.3项下色谱条件进样测定，检测结果见表3。

从表3中可以看出：在此试验方法下除关岭和罗甸产的野生金荞麦未检测到槲皮素外，其余样品均检测出4种指标成分。“黔中金荞麦”4种成分的总含量高于除丹寨外的其他野生金荞麦，采自黔西的“黔中金荞麦”总含量(1189.70 μg/g)优于采自麦坪的“黔中金荞麦”(1108.01 μg/g)。“黔中金荞麦”和黔产的各地野生金荞麦的含量各不相同，且具有一定差异。原花青素B2和芦丁的含量“黔中金荞麦”最高，采自黔西的分别为710.27、71.69 μg/g，采自麦坪的分别为798.79、65.47 μg/g，其中采自麦坪的原花青素B2含量最高(798.79 μg/g)，采自黔西的芦丁含量和槲皮素含量最高(71.69、17.91 μg/g)；除龙里产的野生金荞麦槲皮素含量(15.11 μg/g)高于采自麦坪的“黔中金荞麦”(7.81 μg/g)，采自丹寨的野生金荞麦表儿茶素含量高最高(588.00 μg/g)外，“黔中金荞麦”的表儿茶素和槲皮素的含量均高于其他野生金荞麦。

表3 “黔中金荞麦”与不同产地野生金荞麦中4种成分含量(n=2)Tab 3 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" and wild from different origins (n=2)

3.6.2 生长年限对“黔中金荞麦”的化学成分含量的影响 对采自麦坪不同生长年限的“黔中金荞麦”根茎供试品溶液按照2.3项下色谱条件进样测定，检测结果见表4。

表4 不同生长年限的“黔中金荞麦”中4种成分含量(n=2)Tab 4 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" with different growth years (n=2)

表4的试验结果显示：在4种指标成分含量上，前3种成分含量在第2年采收时含量达到最高，总含量也达最高，槲皮素含量无明显规律性变化，第3年含量最高，有逐年累计的可能，或者是在生长过程中，芦丁受影响发生水解产生槲皮素，造成槲皮素含量升高，但第3年时4种成分总含量急剧减少。为充分利用资源，且考虑其总体成分含量以及治疗作用，故适宜在“黔中金荞麦”生长第2年时采收。

3.6.3 采收时间对“黔中金荞麦”化学成分含量的影响 对不同时间采收的“黔中金荞麦”根茎供试品溶液按照2.3项下色谱条件进样测定，检测结果见表5。

表5 不同采收时间的“黔中金荞麦”中4种成分含量(n=2)Tab 5 Contents of 4 components in "Qianzhong Golden Buckwheat" at different harvest times (n=2)

表5结果显示：不同采收时间对4种指标成分含量的影响未呈现出一定的趋势，6月份与12月份采收在总含量上差异不明显，总体综合来看12月采收较好，不仅成分含量高，且金荞麦地上部分也具有一定的经济利用价值，能在冬季枯死之前地上部分作为青绿饲料加以利用，降低养殖成本，提高经济效益。

综合评价，在此试验方法下，“黔中金荞麦”的物质含量丰富，品质佳，其中以来自黔西的“黔中金荞麦”在此4种指标成分评价下，品质最佳。以12月份、2年生的“黔中金荞麦”采收最适宜，活性物质成分含量高。

4 讨论与结论

金荞麦中物质成分丰富、复杂，含有各类化学成分，主要是多酚类、黄酮类、甾体类和萜类等化学成分，以较大极性类物质居多，具有治疗糖尿病、抗癌、抗氧化、抗菌以及增强免疫等多种药理作用，是一种具有良好开发前景的中药。金荞麦中含有大量黄酮类物质，如表儿茶素、芦丁、槲皮素、异鼠李素、儿茶素和原花青素B2等黄酮单聚体和一些二聚体等物质[9]，黄仁术等[10]研究发现其中表儿茶素具有明显抗菌消炎作用，黔中金荞麦中表儿茶素含量较高，达到中国药典含量测定要求，而丹寨产的野生金荞麦中表儿茶素含量近乎是药典标准的两倍。冯黎莎、王立波等[11-12]研究发现金荞麦的根茎和茎叶都具有一定的抑制细菌和真菌的作用，且金荞麦中的黄酮以及多酚类化合物对乙型溶血性链球菌和肺炎球菌具有抑制作用。还可以保护由肺炎球菌菌株所致的小鼠感染，可能与其中的原花青素B2对细胞的保护作用有关[13]；同时，金荞麦中的多酚类和黄酮类物质还具有较强的总抗氧化能力和抗脂质过氧化作用[14-15]。程友斌等[16]对金荞麦不同提取部位进行抗炎测试研究，发现氯仿和水液为抗炎活性部位，具有显著的抗炎作用，推测其活性物质可能是中等极性和较大极性类型的物质成分，如黄酮类、多酚类以及萜类等类型的物质，具体的活性物质类型还需进一步研究。金荞麦具有很好的、广泛的药理作用，体现出其巨大的药用价值，从各研究中可以看出，其药理作用与其植物体内的黄酮类、酚酸类、萜类等物质有极大关系。在此试验中可以看出，“黔中金荞麦”黄酮类物质总含量高于野生金荞麦，尤其是槲皮素含量较高，可能在药理作用和疗效方面也存在一定的优势，具有良好的药用价值，为其作为药用资源开发利用提供了物质基础。

黔产的野生金荞麦含量各不相同，差异较大，质量不稳定，成分总含量低，但丹寨野生金荞麦总含量显著高于其他野生金荞麦，可能和贵州各地区海拔梯度有关，进而影响阳光、水分等吸收，以及土壤、环境等差异，导致植物物质成分的差异，体现出贵州地势地理环境的多样性，从而导致植物物质成分的多样性。而采自黔西和麦坪两地的“黔中金荞麦”在此试验条件下显示，在总含量上差异不明显，各成分含量均较高，优于黔产野生金荞麦，也优于云南与重庆产的野生金荞麦，且质量稳定，体现出自主选育的“黔中金荞麦”的优势、价值和意义。

本试验建立了以HPLC同时测定“黔中金荞麦”中原花青素B2、表儿茶素、芦丁和槲皮素4种成分含量的方法，适用于 “黔中金荞麦”的含量测定，也可用于“黔中金荞麦”的质量控制。“黔中金荞麦”活性物质丰富、总黄酮含量高，质量稳定，符合中国药典和中国兽药典对金荞麦的含量测定标准，即表儿茶素含量(C15H14O6)≥0.03%(按干燥品计算)，可为该药材在临床的应用奠定物质基础。“黔中金荞麦”作为一种高蛋白低纤维、营养丰富的牧草资源，采用本试验建立的检测方法明确其内控质量，可大面积示范推广种植，运用于畜禽养殖具有一定的经济效益和社会效益。