化痰祛瘀方对心房颤动大鼠血管细胞黏附分子-1及血管性血友病因子的影响

韩乔木,宫丽鸿,吴启华,史富羽,赵 帅,肖福龙

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032)

心房颤动(Atrial fibrilltion，AF)归属于中医学“心悸”“怔忡”范畴，常见心悸不宁、时发时止、善惊易恐、胸闷烦躁等症状，多由痰浊、血瘀、水饮等实邪阻滞所致，国内研究显示，房颤患者证型以气虚血瘀、气阴两虚、痰浊血瘀证最为多见[1]。流行病学显示，房颤早期多呈现阵发性，随发作频率增加，逐渐转为持续性房颤。研究显示,房颤引发卒中的风险随年龄增长而升高，50岁以上患者患病风险升高1.5%，80岁以上患者风险可达25%[2]。房颤的发生发展机制包括电重构、结构重构、炎症等方面。近年研究显示，抑制炎症反应发生可降低房颤发病风险，提高患者生活质量[3-4]。同时，因损伤等因素使血管内皮细胞处于应激状态，血浆中血管性血友病因子(Vascular hemophilia factor,vWF)浓度升高，增加卒中事件发生率[5]。本研究通过观察化痰祛瘀方对房颤模型大鼠房颤持续时间，透射电镜下心房肌细胞超微结构变化，探讨化痰祛瘀方对房颤大鼠的治疗作用及对血清中血管细胞黏附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、vWF的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD大鼠60只，雄性，体重300～400 g，动物合格证号SYXK(辽)2013-0009,购于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物伦理审查编号21000042021021。

1.1.2 实验药物：化痰祛瘀方由辽宁中医药大学附属医院熬制，规格100 ml/袋，放置于冰箱-4 ℃冷藏保存。药物组成：陈皮、苦参、丹参各15 g，清半夏、竹茹、麸炒枳壳、炙甘草、甘松各10 g，桂枝6 g，龙骨、牡蛎各25 g(后下)，僵蚕5 g，熟三七粉2 g。盐酸维拉帕米片(国药准字H12020051，天津市中央药业有限公司)；氯化乙酰胆碱(批号S30170-5，源叶生物科技有限公司)；无水氯化钙(批号S24110-500g，源叶生物科技有限公司)；10%水合氯醛溶液(规飞净生物科技有限公司)。

1.1.3 实验试剂及仪器：vWF、VCAM-1 ELISA试剂盒均购自于北京诚林生物科技有限公司。PowerLab 15T多导电生理记录仪(型号ML4818，上海埃德仪器国际贸易有限公司)；精密电子天平(丹佛仪器北京有限公司)；SIS透射电镜数字摄像头(型号ORADA，德国EMSIS公司)；哺乳动物类手术器械一套。

1.2 实验方法

1.2.1 房颤大鼠模型建立：本实验造模依照《SD大鼠房颤模型的建立》[6]，准备雄性SD大鼠60只，喂食高脂饮食3周后，随机分为空白组、模型组、中药低浓度组、中药中浓度组、中药高浓度组、维拉帕米组，每组10只。除空白组外其他五组SD大鼠以0.1 ml/100 g剂量进行尾静脉注射乙酰胆碱氯化钙混合液制备痰浊血瘀型房颤大鼠模型，连续注射7 d；造模第7天，对模型大鼠称重，予以10%水合氯醛溶液，以0.3 ml/100 g剂量进行麻醉。将大鼠呈仰卧位置于木板上，用橡皮筋固定四肢，将金属针头插入已消毒的四肢皮下，导联末端蘸盐水夹于针头暴露端，连接Power Lab 15T多导电生理记录仪，测量Ⅱ导联心电图，动态观察5 min。将造模成功的房颤大鼠依照《药理实验方法学》[7]进行给药，人与动物按体表面积折算的等效剂量比值(1∶6.25)系数折算。造模成功后第2天灌胃，灌胃体积为3 ml，中药各剂量组按高、中、低浓度分别给予41.25、20.63、10.31 g/(kg·d)化痰祛瘀方溶液灌胃；维拉帕米组给予维拉帕米溶液25 mg/(kg·d)灌胃，连续灌胃2周。各组大鼠灌胃期间在灌胃1 h后进行尾静脉注射乙酰胆碱氯化钙混合液，1次/d。

1.2.2 造模前后大鼠心电图房颤持续时间比较：对造模前、后大鼠测量Ⅱ导联心电图，见图1。造模成功后，对大鼠给药，并记录房颤持续时间，以心电图中f波出现、P波消失、P-R间期绝对不等为房颤发生的标记，以P波出现、f波消失为房颤终止标志。

图1 大鼠造模前后心电图比较

1.2.3 透射电镜观察各组大鼠心房肌细胞超微结构变化：开胸暴露心脏后，用移液枪抽取少许戊二醛固定液，滴于活体组织上，剪取心脏，置于含有4 ℃戊二醛固定液的载玻片上，再用硬质刀片在左心房部位剪取小块组织，修剪成1 mm×1 mm×1 mm小块，放入盛有1 ml的4%戊二醛固定液的EP管中，确保样品完全进入固定液中，置于4 ℃冰箱暂放。

1.2.4 酶联免疫法测定大鼠血清中VCAM-1及vWF水平：ELISA法测定各组大鼠血清中VCAM-1、vWF水平，酶标仪检测各孔OD值，计算指标浓度，操作严格按试剂盒说明进行。

2 结 果

2.1 各组大鼠房颤持续时间比较 见表1。造模7 d后，模型组、中药低浓度组、中药中浓度组、中药高浓度组、维拉帕米组大鼠的房颤持续时间均长于与空白组，差异有统计学意义(均P<0.01)，提示房颤大鼠造模成功。对房颤大鼠给药后，中药高浓度组、中药中浓度组、中药低浓度组、维拉帕米组大鼠房颤持续时间均短于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)。各给药组间大鼠房颤持续时间比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表1 各组大鼠房颤持续时间比较(s)

2.2 透射电镜下各组大鼠心房肌超微结构比较 见图2。空白组大鼠心房肌细胞的肌小节完整清晰，“Z”带排列整齐连贯，清晰有序，“I”带清晰可见，肌丝排列整齐紧密，线粒体结构正常，线粒体嵴排列紧密，结构完整，未见闰盘分离现象。模型组大鼠心房肌细胞的肌小节断裂，“Z”带不连续，排列混乱，“I”带模糊不清，心肌细胞肌丝溶解断裂，出现空隙，线粒体肿胀、增多，甚至破裂，嵴断裂溶解，聚集在一起，呈空泡样改变。中药高浓度组大鼠心房肌细胞的肌小节轻微断裂，排列相对整齐，肌丝稍有溶解，线粒体轻度肿胀、轻度增多，嵴溶解明显减少，结构相对完整，闰盘分离现象改善。中药中浓度组大鼠心房肌细胞的肌小节相对完整，“Z”带有错位现象，排列整齐，肌丝稍模糊，线粒体肿胀，偶见线粒体溶解，结构相对完整。中药低浓度组大鼠心房肌细胞的肌小节断裂，“Z”带不连续，排列不整齐，“I”带模糊不清，线粒体肿胀、增多，嵴断裂溶解，个别结构不完整。维拉帕米组大鼠心房肌细胞的肌小节轻微断裂，“Z”带增宽、中断、不连续，排列相对整齐，“I”带稍模糊，线粒体增多、聚集在一起，部分嵴断裂溶解。

图2 各组大鼠心房肌细胞超微电镜下结构(×10000)

2.3 各组大鼠血清VCAM-1及vWF浓度比较 见表2。造模成功后，对各组大鼠按实验设计的要求给药，连续给药2周，给药结束后应用ELISA法测定房颤痰浊血瘀证大鼠血清中VCAM-1、vWF浓度。模型组大鼠血清VCAM-1、vWF浓度均高于空白组大鼠血清VCAM-1、vWF浓度，差异有统计学意义(均P<0.01)。中药高浓度组、中药中浓度组大鼠血清VCAM-1浓度均低于模型组大鼠血清VCAM-1浓度，差异有统计学意义(均P<0.05)；中药高浓度组、中药中浓度组、中药低浓度组、维拉帕米组大鼠血清vWF浓度均低于模型组大鼠血清vWF浓度，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表2 各组大鼠血清VCAM-1 及vWF比较

3 讨 论

近年来，中医药治疗房颤的优势越来越大，其具有不良反应较小、药效持久、患者依从性高、可多离子通道、多靶点共同作用等特点，能显著改善患者临床症状、预后。现代中医治疗多以化痰息风，活血化瘀，温阳安神，滋阴定悸，补脾益肺为治法[8]。本实验化痰祛瘀方由陈皮、清半夏、竹茹、麸炒枳壳、桂枝、炙甘草、龙骨、牡蛎、苦参、甘松、僵蚕、丹参、熟三七粉等药物组成，在温胆汤、桂枝甘草龙骨牡蛎汤基础上进一步创新，以祛痰化瘀、息风定悸为治疗大法，治疗心房颤动。温胆汤源于孙思邈所著《备急千金要方》，主治胆虚痰热内扰之证，以清热化痰，理气通络之法起到祛除痰瘀诸邪的作用。桂枝甘草龙骨牡蛎汤出自《伤寒论》第118条，原方中增加龙骨、牡蛎于桂枝甘草汤中，以求振奋心阳，活血通络，治疗伤寒误下所致心阳虚，心神不能潜敛的烦躁。在心阳的推动和温煦作用下心脏有节律搏动，并维持心率、心律，是心搏跳动之源，是心脏射血的基础。窦房结是正常心脏电活动的起源，两方合用，加减化裁意在振奋心阳，恢复正常窦房结功能，保证心脏正常电活动。

近年来，研究者们发现房颤的电重构和结构重构是维持房颤主要因素。房颤发作时伴随的心房肌细胞结构重构，将加剧心房内的传导阻滞，成为维持房颤发生的重要基础[9]。本实验中在透射电镜观察发现，给予化痰祛瘀方治疗后，中药中、高浓度组大鼠心房肌细胞的肌丝较少溶解，嵴溶解明显减少，闰盘分离现象改善、结构相对完整，并且房颤发作的持续时间也缩短，说明中、高浓度化痰祛瘀方治疗痰浊血瘀型房颤大鼠，可改善心房肌细胞超微结构，延缓心房肌纤维化进程，缩短大鼠房颤发作时间。

VCAM-1是黏附因子免疫球蛋白家族成员，往往与淋巴细胞、单核细胞VLA-4相结合形成 VLA-4-VCAM-1复合物，继而引发血管内皮细胞与单核细胞、淋巴细胞黏附，导致血管内皮损伤[10-11]。既往研究显示，房颤患者的内皮细胞损伤与血清VCAM-1水平呈正相关性[12-13]。VCAM-1也在维持血栓斑块稳定、防止斑块破裂中起重要作用[14-15]。本实验中模型组房颤大鼠血清VCAM-1水平明显升高，而大鼠在中、高浓度化痰祛瘀方干预后，则血清VCAM-1有所下降，说明化痰祛瘀方能保护血管内皮。

vWF主要由血管内皮细胞合成，密切参与动脉血栓形成过程。其具体作用为：在血管内皮损伤条件下，与血小板聚合，形成血小板-GPⅡb/Ⅲa-vWF复合物，促使游离端血小板聚集，导致血栓形成[16]；作为凝血因子Ⅷ载体蛋白，维持凝血因子Ⅷ的稳定性[17]。既往研究显示，房颤患者较窦律患者血管内皮细胞损害更为严重，血清vWF水平更高，能够更加敏感地反映血管内皮损害情况[18-19]。本实验中，不同浓度化痰祛瘀方治疗，可使vWF浓度下降，说明其能有效预防血栓形成，降低卒中风险。

现代药理学研究表明，温胆汤中陈皮、竹茹、枳壳能降低血脂，减少免疫细胞对血管壁的黏附，从而延缓血管斑块的进展，实现对血管内皮细胞的保护作用[20]。桂枝甘草龙骨牡蛎汤中富含桂皮醇、桂皮醛等物质能有效抗血小板聚集[21-22]。甘草酸、甘草次酸、甘草黄酮在抗血栓形成的同时还能有效抗心律失常[23-25]。僵蚕的有效成分可直接影响血管内皮细胞上凝血酶水解，延长凝血时间，维持纤溶系统平衡，减少血栓形成[26-28]。苦参、甘松两味中药的有效成分苦参碱、甘松挥发油，能阻滞钾、钠离子通道，联合使用可抗心律失常[29-31]。熟三七粉中富含的三七总皂苷，能抑制炎症反应，减少房颤发生频率及发生时间[32-34]，具有抗心律失常、抗动脉粥样硬化作用[35-37]。丹参水溶性部分中有效成分丹参素可有效抑制VCAM-1表达，具有抗凝血，抗体外血栓形成作用[38-40]。

综上所述，化痰祛瘀方对房颤大鼠治疗作用较好，可缩短房颤持续时间，延缓心肌细胞纤维化，降低房颤大鼠血清中VCAM-1、vWF水平，保护血管内皮细胞，降低心脑血管事件发生风险。