基于网络药理学探讨桃红四物汤治疗糖尿病周围神经病变作用机制

王倩倩，刘永惠，王 蒙，孙连庆

(西安交通大学第一附属医院中医科，陕西 西安 710061)

目前，全球范围内，糖尿病的患病率持续上升，据国际糖尿病联盟统计，2017年全球约有糖尿病患者4.15亿，预计到2040年，全球糖尿病患者可能达到6.42亿[1-2]。糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病常见的慢性并发症之一，90%以上的糖尿病患者伴有不同程度的周围神经病变[3]。糖尿病周围神经病变是糖尿病患者高致残率、高病死率的因素，目前针对DPN治疗药物却非常有限[4-5]。临床发现，桃红四物汤在改善DPN临床症状方面效果较好，但作用机制尚不清楚。

网络药理学是一门运用网络方法分析药物与疾病之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系的药理学分支学科。该方法既考虑了药物之间的相互作用，也考虑了复方的复杂性和多样性，与中医的“整体观念”“辨证论治”有异曲同工之妙。因此，网络药理学被广泛用于探究中药复方干预疾病的作用机制研究。本研究拟采用网络药理学技术和方法，对桃红四物汤有效活性成分、靶点进行筛选，分析其治疗DPN的作用机制，为桃红四物汤治疗DPN的基础研究提供方向。

1 资料与方法

1.1 资料来源 本研究的文献来源与分析平台包括中药系统药理学数据库及分析平台(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)、Gene Cards数据库、OMIM数据库、Uni Prot数据库、String数据库、Cytoscape 3.7.2软件、R 3.8.6软件。

1.2 研究方法

1.2.1 桃红四物汤主要活性成分及作用靶点筛选：TCMSP数据库具有识别药物有效成分、作用靶点的能力，在该数据库中分别检索桃仁、红花、熟地黄、当归、白芍、川芎六味中药的化学成分，按照口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%，类药性(Drug likeness,DL)≥0.18筛选药物活性成分，进而筛选有效成分作用靶点，利用Uni Prot数据库查询人源靶蛋白，进而将靶蛋白转换为对应的靶基因，最终获得靶基因的缩写名称。

1.2.2 疾病靶点筛选：以“Diabetic peripheral neuropathy”为关键词，通过Gene Cards数据库和OMIM数据库筛选DPN相关的疾病靶点基因信息，Excel中删除重复基因并进行合并，得到DPN的靶基因，再将DPN靶基因信息与桃红四物汤的靶基因进行匹配得到两者的共同靶基因，即为桃红四物汤治疗DPN的潜在靶基因。

1.2.3 蛋白互作(PPI)网络构建：将桃红四物汤有效成分对应靶基因和DPN靶基因输入在线软件作图工具平台绘制韦恩图。两者交集靶点基因导入String数据库进行靶基因间的蛋白互作分析，物种限定为Homo sapiens,设定置信度>0.4代表两个蛋白间有互作关系，构建PPI网络图。以网络中各靶基因的节点连接度值(Degree)为指标，筛选出网络中的核心蛋白质靶标，以R软件绘制Degree 排名前30的靶点柱状图。

1.2.4 构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络：基于桃红四物汤活性成分靶点与DPN靶点之间的相互作用关系，通过Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络。

1.2.5 GO富集和KEGG通路分析：为进一步筛选出桃红四物汤作用靶点蛋白，在基因功能及信号通路中的生物学效应，采用R软件Bioconductor包分别进行GO富集和KEGG通路分析。

2 结 果

2.1 桃红四物汤活性成分及靶点筛选 从TCMSP 数据库中得到桃红四物汤化学成分，通过OB值、DL值筛选各单味药中的潜在活性成分，共获得桃红四物汤43个活性成分。从TCMSP 数据库中筛选出855个桃红四物汤作用靶点，将筛选出的靶蛋白输入Uni Prot数据库，查询靶蛋白简称，去重后得到桃红四物汤212个靶点基因。

2.2 疾病靶点筛选 在Gene Cards数据库和OMIM数据库以“Diabetic peripheral neuropathy”为关键词，筛选DPN相关的疾病靶点基因信息，去重后收集到DPN靶点基因4662个。

2.3 桃红四物汤活性成分与DPN共同靶点韦恩图 将桃红四物汤活性成分相关的212个靶点和糖尿病周围神经病变的4662个靶点输入Bioinformatics & Evolutionary Genomics在线软件作图平台，绘制韦恩图，两者交集为桃红四物汤活性成分与DPN共同靶点，共150个(图1)。图中蓝色代表桃红四物汤活性成分靶基因，黄色代表DPN靶基因，二者交集为桃红四物汤活性成分-DPN共同靶基因。

图1 桃红四物汤活性成分与DPN靶点韦恩图

2.4 PPI网络的构建 将筛选出的桃红四物汤活性成分与DPN的交集靶点基因导入在线网站String进行靶基因间的蛋白互作分析，构建PPI网络图(图2)。PPI网络图中节点表示蛋白质靶点，每条边则表示蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系，网络中共150个节点，2826条边，节点平均度为37.7。通过R软件绘制桃红四物汤-DPN核心靶基因，其中AKT1、JUN、MAPK1、HSP90AA1、RELA是桃红四物汤作用DPN的核心基因。

图2 桃红四物汤与DPN共同靶点PPI网络图

2.5 构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图 利用Cytoscape软件构建桃红四物汤药物-成分-靶点-疾病可视化图(图3)。图中蓝色代表桃红四物汤；红色代表桃红四物汤中药物的活性成分；绿色代表桃红四物汤与DPN共有靶基因；黄色代表DPN。桃红四物汤中作用于DPN的化学成分有43个，连接点多的药物活性成分主要包括槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、黄芩素。

图3 “药物-成分-靶点-疾病”网络图

2.6 GO富集分析 使用R软件Bioconductor对150个共同靶点基因做GO富集分析，得到GO条目155个，根据P-value值大小进行排序，选取前20条目可视化得到气泡图(图4)。图中横坐标代表基因富集数，纵坐标代表功能富集；结果显示桃红四物汤主要作用细胞膜，通过影响核受体活性、配体激活转录因子活性、类固醇激素受体、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等过程，参与化学应激、氧化应激、抗生素、脂多糖等反应。

图4 桃红四物汤与DPN共有靶基因GO富集分析

2.7 KEGG通路富集分析 使用R软件Bioconductor对150个共同靶点基因做KEGG通路富集分析，得到166条通路，根据P-value大小进行排序，选取前20条目可视化(图5)。图5A中横坐标代表通路中富集基因数目，纵坐标代表通路富集。图5B红色大小代表通路中基因数目多少；绿色代表各个通路中的具体靶基因；绿色大小代表基因在通路中出现的次数。KEGG通路富集分析显示靶点基因显著富集于糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、前列腺癌、TNF信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染等多种途径。

图5 桃红四物汤与DPN通路富集分析图

3 讨 论

中医将糖尿病归属于“消渴病”范畴，后世医家根据DPN临床表现将其归属于“消渴痿证”“消渴痹证”范畴[6]。历代医家对DPN的发病机制进行探索，普遍认为DPN多因消渴病程日久，阴损及阳，使患者气血亏虚，阴阳失调，虚实夹杂，导致瘀血阻滞，脉络痹阻，可见“瘀血”是糖尿病周围神经病变的核心病机[7-8]。桃红四物汤是活血化瘀的经典方剂，在治疗DPN方面具有较好的临床效果，但作用机制尚不清楚[9-12]。

通过应用网络药理学的方法，对桃红四物汤的成分进行了分析，筛选出桃红四物汤有效活性成分43个，其中Degree排名前6位的化学成分是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、黄芩素。槲皮素是一种多酚类黄酮化合物，主要通过调节谷胱甘肽、酶活性、活性氧及信号转导途径维持氧化平衡[13]。研究发现，槲皮素的摄入量与2型糖尿病的患病率成反比，槲皮素可通过降低组织中的山梨醇，改善Na+-K+-ATP酶活性，减轻四氧嘧啶诱发DPN损伤[14-15]。山奈酚是一类黄酮类化合物，研究发现其可降低血糖，改善胰岛素敏感性，同时可通过抗氧化应激、抗炎、抑制细胞凋亡，减少糖尿病及其并发症的发生[16-17]。β-谷甾醇是一种常见的植物甾醇，研究发现其可通过抗氧化、抗炎的作用抑制糖尿病及其并发症的进展[18]。豆甾醇是一种植物甾醇，研究发现豆甾醇可通过增加血液中胰岛素浓度，降低血糖浓度，同时豆甾醇可通过增加活动的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽发挥抗氧化活性作用，抑制糖尿病并发症的发生发展[19-20]。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，研究发现木犀草素可明显改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗作用，通过抗氧化、抗炎途径抑制糖尿病并发症的发生发展[21-23]。黄芩素是黄酮类化合物之一，研究发现黄芩素可减轻胰岛损伤，通过抗氧化应激，抑制PKC、p38MAPK及多元醇途径延缓DPN的发生[24]。根据网络药理学推测桃红四物汤治疗DPN的有效成分主要为槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素、黄芩素。

本研究筛选出药物-疾病的共同靶标蛋白150个，这些蛋白主要作用于细胞膜，通过 AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、前列腺癌、TNF信号通路参与氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等过程。AKT1、JUN、MAPK1、HSP90AA1、RELA是以上信号通路中的核心蛋白。AKT1是AKT家族成员之一，AKT是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT信号通路的中心环节，PI3K/AKT信号通路的激活可抑制炎症反应、细胞凋亡，在糖尿病及其并发症的发生发展过程中发挥重要作用。JUN、RELA属于转录因子，主要通过调节免疫炎症反应参与DPN的发生发展。MAPK1是MAPK家族的主要成员，在神经元细胞死亡和再生中起重要作用。HSP90AA1是热休克家族的重要成员，是细胞间重要的分子伴侣蛋白，主要参与细胞存活、信号转导、转录调控和炎症反应过程，是DPN发生发展的重要分子。