姜黄素对人口腔黏膜上皮细胞系增殖及Wnt/β-catenin信号通路的影响

周婷婷，谭 劲，吴 丹，刘 寻，李 群

(湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

口腔癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，尽管目前在癌症诊断和治疗方面取得了一定进展，但口腔癌患者的5年生存率仅为50%[1]。口腔癌的传统治疗依赖于手术、放射治疗(外束放射治疗和/或近距离放射治疗)及化疗(顺铂等)，但口腔癌早期症状隐蔽，大部分患者确诊时已是中晚期，错过最佳手术时机。虽然以上治疗方式可提高患者生存率，但不良反应较多，还会产生耐药性，限制临床疗效。近年来，传统中药由于不良反应少、安全性高、作用多靶点，且能够有效抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡，在口腔癌的治疗中表现突出。姜黄，味辛、苦，温，归脾、肝经，具有破血行气，通经止痛功效；《本草纲目》曰其主治“风痹臂痛”。姜黄素是从中药姜黄根茎中提取的多酚类化合物，具有多酚植物化学特性。各项研究表明，姜黄素及其衍生物具有广泛的生物活性，有神经保护、抗癌、抗炎等多种功效，且在治疗口腔癌[2]、直肠癌[3]、胃癌[4]等恶性肿瘤中疗效较好。基于此，本研究选取人口腔上皮癌Ca9-22细胞为研究对象，探究不同浓度姜黄素对Ca9-22细胞增殖的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞：人口腔上皮癌Ca9-22细胞购自上海钰博生物科技有限公司。

1.1.2 实验药物与仪器：姜黄素(批号LD-1109680，国药集团化学试剂有限公司)；胎牛血清(批号1658396，美国Hyclone公司)；MEM培养基(批号1760237，美国Hyclone公司)；DMSO培养液(批号BCBR6170V，美国Sigma公司)；胰酶(批号2750018，美国Gibco公司)；MTT溶液(批号A1720090，美国Aladdin公司)；碘化丙啶(批号B07T00102，北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；0.05%胰酶-EDTA(批号25300-054，美国Life Technologies公司)；磷酸盐缓冲液(批号20140918，北京索莱宝科技有限公司)；Bcl-2(批号sc-7382，美国Cell Signaling公司)；Bax(批号sc-4239，美国Cell Signaling公司)；β-catenin(批号8480，美国Cell Signaling公司)；兔抗Wnt1多克隆抗体(批号251822，成都正能生物有限公司)；C-myc多克隆抗体(批号EPR17924，英国Abcam公司)；Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒(批号AC030、AC062，Beyotime公司)；细胞裂解液(批号031020200604，上海碧云天生物技术有限公司)；硝酸纤维素膜(批号FFN03，上海碧云天生物技术有限公司)；β-巯基乙醇(批号20160322，白鲨生物公司)；青霉素(批号25465787，上海国药集团)；链霉素(批号5465687，上海国药集团)；Bradford蛋白定量试剂盒(批号053117171218，上海碧云天生物技术有限公司)；实时荧光定时PCR系统(型号Light Cycler480，瑞士Roche公司)；酶标仪(型号VICTOR X5，美国Perkinelmer公司)；BX53MRF-S显微镜(日本Olympus公司)；垂直电泳仪(型号DYY-6C，北京六一生物科技有限公司)；CO2培养箱(型号MIR-162-PC/MIR-262-PC，日本松下公司)；流式细胞仪(型号FACSCantoⅡ，BD Biosciences公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组：取对数期生长的Ca9-22细胞在MEM培养基中进行传代培养，并添加10%胎牛血清、新鲜完全培养液100 μl，培养液中含100 U/L青霉素、100 mg/L链霉素。所有细胞均置于饱和湿度、37 ℃的5%CO2培养箱中。

1.2.2 MTT法检测细胞存活率：将处于生长对数期的Ca9-22细胞经胰酶消化后，以3×105细胞密度接种于6孔细胞培养板中，待细胞完全贴壁，加入姜黄素使最终浓度分别为5、10、20、40 μmol/L，设为姜黄素处理组，0 μmol/L为对照组，每组3个复孔。干预24、48、72 h后，培养基中加入0.5 mg/ml的MTT溶液，37 ℃避光孵育3 h。洗涤细胞，然后向培养孔中加入1 ml的0.04 mol/L盐酸异丙醇溶液，继续孵育15 min。最后，将200 μl反应混合物转移到96孔平底板的孔中，在450 nm处测量吸光度，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组D450nm/对照组D450nm)×100%。实验重复3次，取平均值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率：将Ca9-22细胞接种到T25烧瓶中，分别用5、10、20、40 μmol/L的姜黄素处理，37 ℃暴露48 h。暴露后，使用0.05%胰蛋白酶和0.01%EDTA从烧瓶中分离细胞，离心，用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗涤，将沉淀悬浮在300 μl的PBS中，并与0.5 μl膜联蛋白V-FITC和10 μl碘化丙啶室温避光15 min。使用来自BD Biosciences的FACSCantoⅡ流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.2.4 Caspase-3、Caspase-9活性检测：PBS漂洗对照组及5、10、20、40 μmol/L姜黄素处理48 h后的人口腔上皮癌Ca9-22细胞，加入细胞裂解液后振荡、离心5 min，吸取上清，按照Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒操作步骤测蛋白浓度。然后在405 nm波长处测光密度值，通过标准曲线法计算Caspase-3、Caspase-9活性。

1.2.5 免疫印迹法检测Wnt/β-catenin通路相关基因及蛋白表达：取对数生长期Ca9-22细胞，接种于6孔细胞培养板中，每孔2 ml，于5% CO2培养箱中培养至90%融合，随机分为对照组和不同浓度的姜黄素处理组(5、10、20、40 μmol/L)，置于培养基中继续培养。24、48、72 h后常规消化收集于离心管，2500 r/min离心5 min，弃上清，加入100 ml预冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min离心30 min，提取细胞总蛋白。蛋白质浓度由Bradford法测定。将20～60 μg的混合物添加到含有10%β-巯基乙醇的等量上样缓冲液中，并通过7%～15%丙烯酰胺凝胶迁移。电泳分离后，将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，在24 ℃的5%脱脂牛奶溶液中封闭1 h，然后在适当浓度抗体的培养箱中放置过夜，最后通过ECL成像系统进行条带检测。

2 结 果

2.1 姜黄素对人口腔上皮癌Ca9-22细胞增殖的影响 使用5、10、20、40 μmol/L姜黄素处理人口腔上皮癌Ca9-22细胞24、48、72 h后，采用MTT法检测细胞存活率，细胞存活率随姜黄素浓度的升高和处理时间的延长而降低，且呈浓度及时间依赖性，见图1。

图1 姜黄素对人口腔上皮癌Ca9-22细胞存活率的影响

2.2 姜黄素对人口腔上皮癌Ca9-22细胞凋亡的影响 对照组、5 μmol/L姜黄素处理组、10 μmol/L姜黄素处理组、20 μmol/L姜黄素处理组及40 μmol/L姜黄素处理组48 h细胞凋亡率逐渐上升，且不同浓度姜黄素处理组的细胞凋亡率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 姜黄素对人口腔上皮癌Ca9-22细胞凋亡率的影响(%)

2.3 姜黄素对人口腔上皮癌Ca9-22细胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表达及Caspase-3、Caspase-9活性的影响 见表2。与对照组比较，不同浓度姜黄素处理组Bax mRNA表达及Caspase-3、Caspase-9活性均升高，Bcl-2 mRNA表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且其作用效果与姜黄素浓度呈剂量依赖性。

表2 姜黄素对人口腔上皮癌Ca9-22细胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表达及Caspase-3、Caspase-9活性的影响

2.4 姜黄素对人口腔上皮癌Ca9-22细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响 与对照组比较，不同浓度姜黄素处理组β-catenin、C-myc、Wnt1蛋白表达均降低(P<0.05)，见图2。

A：对照组；B：5 μmol/L姜黄素处理组；C：10 μmol/L姜黄素处理组；D：20 μmol/L姜黄素处理组；E：40 μmol/L姜黄素处理组图2 姜黄素对人口腔上皮癌Ca9-22细胞β-catenin、C-myc、Wnt1蛋白表达的影响

3 讨 论

口腔癌属中医“牙岩”“上石疽”“失荣症”“口菌”等范畴，病因分为内因和外因，内因为中气损伤，气血失常，虚火上浮；外因为邪气侵犯唇口，导致肾虚唇茧，牙龈溃烂作痛，痰湿聚结[5]。因此，中医治疗口腔癌以扶养正气，提高患者免疫功能为主。相关研究表明，中药姜黄素不仅具有抗氧化，抑制炎症，提高机体免疫功能等功效，还可以抑制口腔癌细胞增殖。刘璐瑶等[6]研究显示，姜黄素通过调节口腔鳞状细胞癌细胞诱导的肿瘤相关巨噬细胞发挥抗癌作用。冯儒学等[7]研究证实，姜黄素通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达，发挥抑制口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖并诱导凋亡的作用。

本研究发现，姜黄素对人口腔上皮癌Ca9-22细胞的增殖有明显抑制作用，且其抑制作用与浓度、时间有关。Semlali等[8]通过体外探索姜黄素类似物(PAC)的抗癌增殖作用，证明PAC有抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡、自噬、氧化应激的作用，且肿瘤细胞对PAC的敏感性高于人牙龈上皮细胞。本研究发现，与对照组比较，不同浓度姜黄素处理组Bax mRNA表达及Caspase-3、Caspase-9活性均升高，Bcl-2 mRNA表达均降低。这可能与下调Bcl-2表达，上调Bax诱导肿瘤Ca9-22细胞凋亡有关。线粒体依赖性细胞凋亡是诱导细胞凋亡的最重要途径之一，Bcl-2是内在途径的中心调节因子，Bax被激活后形成多聚体靠近线粒体膜，使线粒体膜通透性增加、细胞色素C的释放增多并激活线粒体凋亡信号从而发挥诱导凋亡作用，而Bcl-2下调则促进线粒体细胞色素C的释放，与Bax发挥协同抗凋亡作用[9-11]。Caspase-3、Caspase-9是Caspase联级反应的关键效应分子。Caspase-3不仅能接受与执行细胞凋亡信号活化后与特定底物结合刺激癌症细胞凋亡蛋白，还可与Caspase-9结合形成凋亡小体，激活内源性细胞凋亡途径，使聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶片段化、染色质凝集，最终导致细胞凋亡[12-13]。

口腔癌变是复杂的多因素过程，涉及遗传和分子改变，导致细胞增殖失控、DNA修复受损和细胞死亡[14]。在早期阶段，口腔黏膜中潜在恶性病变或口腔发育不良的发作与原位癌和浸润性癌的恶性进展率较高有关[15]。WNT通路涉及多种信号传导和调节通路，如胚胎发生、细胞增殖、迁移和极性、细胞凋亡、器官发生[16]。在成人阶段，WNT通路未激活或沉默，然而在许多机制和病理过程中，如炎症、代谢和神经系统疾病以及癌症，WNT通路可能会失调。多项研究表明，Wnt/β-catenin是关键的诱导肿瘤发生的信号通路，其异常激活与口腔癌在内的各种癌症发生与发展关系密切[17-19]。β-catenin蛋白作为细胞转录调节分子，可结合Wnt1信号通路中的靶位点，激活Wnt1信号通路，进而调节下游靶蛋白C-myc、Cyclin D1表达。本研究发现，不同浓度姜黄素处理组β-catenin、C-myc、Wnt1表达均低于对照组，提示姜黄素可抑制Wnt/β-catenin信号通路的表达。姜黄素通过抑制Wnt/β-catenin通路的激活，阻止髓母细胞瘤细胞的G2/M阶段细胞周期，直接刺激GSK-3β活性，导致核β-catenin水平下降，从而导致C-myc表达下调。吕君等[20]研究也表明，黄芪多糖通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活，下调β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白及Bcl-2基因表达，促进肝癌细胞凋亡。