脱落细胞学检查联合HPV-DNA检测在宫颈癌前病变诊断中的应用

张秀芳

宝坻妇产医院妇科，天津 301800

宫颈癌是一种常见妇科肿瘤，据统计全球每年因宫颈癌死亡人数超过27.5 万，特别是在在发展中国家，因宫颈病变的筛查诊断技术的层次不齐，导致早期诊断很难发现，严重威胁妇女生命健康［1-3］。宫颈癌在早期无明显体征和临床症状，随病情发展可出现阴道排出白色米泔状液体、阴道流血等［4-5］。研究表明［6-7］，宫颈癌病变病情进展较为缓慢，早期诊断来预防宫颈癌发生癌前病变可明显降低死亡率。目前，在临床上主要通过联合人乳头瘤病毒（HPV）检测、液基薄层细胞（TCT）检测等手段筛查［8］。其中，宫颈刮片脱落细胞学检查常用于筛查宫颈癌前病变，主要利用宫颈刮板进行宫颈细胞的取样，是一种无创伤并且有效的检查方法［9］。宫颈癌前病变的主要致病因子是HPV 的持续感染，并在宫颈癌发生和发展过程中发挥重要作用［10］。检测HPV-DNA 能够将筛选感染高危型HPV 女性患者，能够为及时诊治提供依据。本研究选取HPV-DNA检测和宫颈刮片脱落细胞学检查进行筛查宫颈癌前病变的100 例患者，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年3 月—2018 年3 月宝坻妇产医院妇科门诊收治的100 例采用HPV-DNA 检测和宫颈刮片脱落细胞学检查进行筛查宫颈癌前病变的患者作为研究对象，年龄26～64 岁，平均年龄（48.69 ± 6.48）岁。（1）纳入标准：患者没有宫颈手术病史以及子宫切除手术史；患者目前没有妊娠；没有细胞学检查结果异常病史。（2）排除标准：合并其他恶性肿瘤、感染、自身免疫疾病、器质性病变等疾病者；依从性不好，未完成本研究者；哺乳期、妊娠期患者；结蹄组织相关疾病者。本研究经医院医学伦理委员会通过。

1.2 实验方法

宫颈刮片脱落细胞学检查：避开经期，检查前2 d未进行性生活、阴道冲洗或者上药等，患者取膀胱截石，暴露宫颈；采用液基薄层细胞试剂盒中的子宫颈刷采集子宫颈脱落细胞样本置入装有细胞保存液的小瓶进行漂洗，采用全自动制片机处理，分离标本中的黏液、上皮细胞、血液及炎性细胞。细胞通过膜式过滤器负压吸转到膜上，将其转移到经静电处理的载玻片上，混匀细胞制定到的薄层细胞涂片（直径2 cm 左右）2 张，并采用95%浓乙醇进行固定，采用巴氏染色，之后在双盲下让两名病理师采用光学显微镜进行阅片检查，细胞学诊断采用国际癌症协会分级系统分为良性炎症改变、正常细胞、意义不明确的低度鳞状上皮内病变、非典型鳞状细胞、鳞状细胞癌及高度鳞状上皮内病变。TCT检测异常指的是ASCUS及以上病变。

HPV-DAN检测：采用美国ABI公司生产的7500型核酸扩增仪实施PCR 扩增、杂交、洗膜及显色，采用原装的配套试剂HR-HPV 核酸定量检测试剂盒检测HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4 共18 个亚型。用无菌棉签蘸取无菌生理盐水，插入女性的宫颈口，沿内壁旋转5圈，以获取足量的脱落细胞和分泌物，然后将其放入装有洗脱液（1 mL）的洗脱管中待测。将宫颈刷放在洗脱管内漂洗，将洗脱液转移到微量离心管（1.5 mL），10 000 rpm/min 离心10 mim，丢弃上清液，留下管底全部的细胞块。向其中加入50 μL左右裂解液悬浮沉淀，100℃的水浴加热10 min，10 000 rpm/min 离心10 min，保留上清液待用。HPV 的基因扩增：取1 μL 的DNA 抽提液，向其中加入HPV 的PCR 扩增体系，用试剂盒的扩增程序进行扩增反应；最后给予72℃延伸5 min。之后采用导流杂交法HPV 的基因给与分型：将20 μL 有生物素标记的PCR 产物通过变性，和1 mL 预热到45 ℃的杂交缓冲液混合，放置于导流杂交仪上经过5 min孵育然后实施导流杂交。杂交结束再用0.8 mL 杂交缓冲液3 次冲洗。在25 ℃下用封阻液封阻5 min 孵育。封阻结束之后加入0.5 mL 酶标液孵育3.5 min。用冲洗缓冲液A 冲洗杂交膜，去除没有结合的酶标液，显色期间加入0.5 mL 的四唑硝基蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物在36 ℃条件下保持5 min 或显色完成结束。在显色后1 h内察看分析结果。

病理学检测：将以上异常结果的患者进行病理学活检，并以病理学结果为标准。在受检者月经干净后1周由经验丰富的阴道镜专业医师进行检查，把阴道窥器放入阴道后将宫颈表面分泌物擦净，然后用3%冰醋酸棉球将宫颈浸湿，采用阴道镜对可疑部位多点取材，组织标本常用1%甲醛溶液固定，然后进行病理学检测。观察柱状上皮、鳞状上皮及转化区的形态及颜色变化，当发现异常阴道镜图像后，用卢戈碘液涂抹宫颈，多点活检点状血管、白色上皮等组织。结果分别为宫颈上皮内瘤变（CIN）及炎症反应，根据病变程度分为Ⅰ～Ⅲ级及浸润癌3类。

1.3 分析方法

以组织活检诊断为标准，HPV-DNA 检测和宫颈刮片脱落细胞学检查结果与组织活检诊断结果进行对照，计算出两者联用筛查宫颈癌前病变的敏感度和准确性以及阳性和阴性预测值。

2 结果

2.1 宫颈刮片脱落细胞学、HPV-DNA 检测和活组织病理检查结果

宫颈刮片脱落细胞学检查结果：正常范围者71 例，未明确意义的不典型鳞状上皮细胞者14 例（14.00%）。低度鳞上皮内病变者10 例（10.00%），低度鳞状上皮内病变者4例（4.00%），鳞状上皮浸润癌者1 例（1.00%）。高危型HPV-DNA 检测结果：阳性29 例，阳性率29.00%。病理检查确诊为宫颈病变的患者高危型HPV DNA 阳性率：CIN I 44.44%（12/27），CINⅡ88.46%（23/26），CIN III 91.67%（22/24），官颈浸润癌90.48%（19/21）。

2.2 宫颈刮片脱落细胞学检查联合HPV-DNA 检测的特异度、敏感度以及阳性预测值

以组织活检诊断为确诊标准，分别计算了宫颈刮片脱落细胞学检查联合HPV-DNA检测的敏感度和准确性以及阳性和阴性预测值。两组方法联合检查组的特异度和敏感度显著高于宫颈刮片脱落细胞学检查组和HPV-DNA 检测组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组方法联合检查组的阳性预测值显著高于宫颈刮片脱落细胞学检查组和HPV-DNA检测组差异有统计学意义（P＜0.05），并且联用组阴性预测值比显著低，见表1。表明联用组的确诊能力和排除疾病能力均强于单用组。

表1 宫颈刮片脱落细胞学检查联合HPV-DNA检测的特异度、敏感度以及阳性预测值 %

3 讨论

宫颈癌妇科常见的恶性肿瘤之一，经过医学干预可以有效降低其发病率和病死率，而及时预防和控制宫颈癌的发生发展是提高宫颈癌患者存活几率的关键［11］。上世纪80年代有学者提出HPV 有可能与宫颈癌的发生有关，基于此进行了相关研究［12］。收集宫颈脱落细胞进行相关检查也是宫颈癌早期筛查的重要手段［13］。目前临床上常采用宫颈脱落细胞行TCT 检测，认为优于宫颈刮片取材［14］。在TCT检测时，用软刷使宫颈脱落的细胞粘附在刷毛，然后放在保存液中振荡漂洗，使大部分细胞溶在保存液［15］。因为TCT 技术可用于检出滴虫、念珠菌等，其细胞取材较为广泛，并且在癌前病变及宫颈癌的检测中具有较高的检出率［16-17］。但是TCT 检测具有价格较高及步骤复杂等，在HPV感染诊断中易漏诊［18］。

宫颈癌前病变的重要病因是HPV 感染，特别是年轻患者的病毒自然清除期需8～10个月，不易引起病变，而宫颈病变的前提条件是持续性HPV 感染［19］。目前，HPV 的感染与宫颈癌的直接关联已被证实，并且HPV 与宫颈癌癌前病变密切相关，并且高于99%的宫颈癌患者体内均可检出HPV，而在健康人群中这一比例仅为4%，因此HPV 的检测在评估子宫颈病变的进展中具有重要地位［20］。

相关研究表明［21］，宫颈癌的发生与HPV 联系密切，病毒对机体侵染阶段，HPV 病毒对机体的感染可能会导致机体炎性反应及免疫微环境发生改变，从而间接促进肿瘤细胞发生进展和增殖。在侵染早期，机体能够通过对病毒的免疫抑制将病毒消除，少数者因为病毒发生持续性增殖，可能会导致宫颈上皮细胞发生癌变［22］。本研究中，100 例样本行宫颈刮片脱落细胞学检查，结果表明，两种检查方法联合检查的特异度和敏感度显著高于宫颈刮片脱落细胞学检查组和HPV-DNA检测组，两组方法联合检查组的阳性预测值显著高于宫颈刮片脱落细胞学检查组和HPV-DNA检测组，并且联用组阴性预测值比显著低。表明联用组的确诊能力和排除疾病能力均强于单用组。但针对不同级别的患者的检出率不一致，因此，针对特殊患者应进一步进行病理检测，不应抱有侥幸心理，如细胞学诊断为高度鳞状上皮内病变和鳞状上皮浸润癌级别以上的患者应进一步进行HPV-DNA的检测，阳性者应进一步行阴道镜检测，有必要时进行病理活检［23］。

综上所述，宫颈脱落细胞学检查联合HPV-DNA检测对宫颈癌前病变的筛查和诊断有积极的临床价值。