生血方的鉴别与含量测定

郭怀宇，陈金锋，谢俊杰，郁冬冬，姜 蕾

六安市中医院 药剂科，安徽六安 237001

生血方是六安市中医院生产的医院制剂穴位贴，处方由黄芪、女贞子、当归、炒白术、茯苓、菟丝子、枸杞子等10 味中药组成，具有补肾、活血的功效。该方联合他药常规治疗宫颈癌和胃癌等疾病，经临床验证，临床效果理想[1，2]。黄芪中含有皂苷、黄酮、氨基酸等成分。其中，皂苷类成分具有抗癌等药理作用[3，4]；黄酮类成分具有抗缺血和改善血相作用[5，6]。女贞子中含有三萜、黄酮、多糖类成分，具有抗肿瘤、调节免疫等作用[7]。当归中含有挥发油和有机酸等成分，具有补血、促进免疫等作用[8]。马靖、孟楣等采用高效液相-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）测定黄芪中的黄酮类成分和皂苷类成分[9，10]。本研究通过黄芪等薄层色谱鉴别以及高效液相色谱法（HPLCELSD），建立了黄芪甲甘和芒柄花素的含量测定，用于控制该制剂的质量。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Agilent 1200 高效液相色谱仪（含奥泰ELSD 6000 蒸发光检测器、CSChormPlus 工作站），美国安捷伦公司；BT125D 型电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；KQ-5200DA 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工有限公司）。

1.2 药品与试剂

黄芪甲苷对照品（批号：110781-201717）、芒柄花素对照品（批号：111703-201504），女贞子对照药材（批号：121041-201404）、阿魏酸对照品（批号：121137-201606）均购于中国食品药品检定研究院；生血方（3 批：批号：20180521、20180618、20180713），六安市中医院制剂室自制。乙腈为色谱纯；其他试剂为分析醇；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 黄芪薄层色谱鉴别

2.1.1 供试品溶液制备 取本品6g，研细，加甲醇100mL，超声处理30 分钟，滤过，滤液蒸干，固体物加水20mL 使溶解，用水饱和正丁醇提取4 次（40mL/次），合并正丁醇液，用氨试液洗涤2 次（40 mL/次），弃去氨试液，正丁醇液水浴蒸干，固体物加适量甲醇溶解，定容至1 mL，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液制备 取缺黄芪药材，根据制剂工艺制成相应阴性对照，按“2.1.1”项下方法制备，即得。

2.1.4 鉴别方法 吸取供试品、对照品，阴性对照溶液各5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶7∶2）的下层溶液（10 ℃以下分层静置30 分钟以上）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热约5 分钟，结果见图1A。由图1A 可知，供试品色谱与对照品色谱相应的位置显相同颜色斑点，阴性无干扰。

2.2 女贞子薄层色谱鉴别

2.2.1 供试品溶液的制备 取本品粉末2 g，加稀乙醇50 mL，超声处理30 分钟，滤过，滤液即为供试品溶液。

2.2.2 对照药材溶液的制备 取女贞子对照药材2g，同法制成对照药材溶液。

2.2.3 阴性对照溶液制备 取缺女贞子各药材，根据制剂工艺制成相应阴性对照，按“2.2.1”项下方法制备阴性对照溶液。

2.2.4 鉴别方法 吸取供试品、对照药材、阴性对照溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（30 ℃～60 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点清晰，置日光下检视，结果见图1B。由图1B 可知，供试品色谱与对照药材色谱相应的位置显相同颜色斑点，阴性无干扰。

2.3 当归的薄层鉴别

2.3.1 供试品溶液的制备 取本品粉末6 g，加1%碳酸氢钠溶液50mL，超声处理10 分钟，离心，取上清液用稀盐酸调节pH 值至2～3，用乙醚振摇提取2 次，每次20mL，合并乙醚液，挥干，固体物加甲醇1mL 使溶解，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液，即得。

2.3.3 阴性对照溶液制备 取缺当归各药材，根据制剂工艺制成相应阴性对照，按“2.3.1”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3.4 鉴别方法 吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（1∶1∶1∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图1C。由图1C 可知，供试品色谱与对照品色谱相应的位置显相同颜色斑点，阴性无干扰。

图1 生血方中的薄层鉴别

2.4 黄芪甲苷和芒柄花素含量测定

2.4.1 溶液制备

2.4.1.1 对照品溶液 精密称取黄芪甲苷、芒柄花素对照品适量，加甲醇制成每毫升含黄芪甲苷1.326 mg、芒柄花素0.894 mg 的的混合对照品溶液，摇匀即得。

2.4.1.2 供试品溶液 取生血方粉末约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶，加2%氢氧化钾甲醇溶液100 mL，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）30 分钟，滤过，滤液蒸干，固体物加水10 mL 使溶解，用水饱和的正丁醇提取4 次（30 mL/次），合并正丁醇液，用氨试液洗涤2 次（3 mL/次），弃去氨试液，正丁醇液蒸干，固体物加水5 mL 溶解，过D101 型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm），以50 mL 水洗脱，弃去洗脱液，再用40%乙醇30 mL 洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，固体物加甲醇溶解并转移至5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.1.3 阴性对照溶液 取缺黄芪阴性样品，按照“2.4.1.2”项下方法制备缺黄芪的阴性对照溶液。

2.4.2 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-水（34:66），流速为1mL·min-1，柱温为30 ℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为100 ℃，载气为空气，载气流量为2.6 L·min-1，进样量为20 μL。

在上述色谱条件下，黄芪甲苷和芒柄花素的色谱峰分离比较理想，分离度＞1.5，理论塔板数以黄芪甲苷和芒柄花素计算分别为14166 和23835，且阴性无干扰。对照品、样品及阴性样品色谱图见图2。

图2 对照品（A）、样品（B）、黄芪阴性样品（C）的HPLC 色谱图

2.4.3 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.4.2”项下色谱条件进样20 μL 测定。以进样量的对数和对应峰面积对数得到回归方程，结果见表1。

表1 回归方程和线性范围

2.4.4 进样精密度试验 取同一混合对照品溶液，连续进样6 次，计算峰面积，结果黄芪甲苷和芒柄花素峰面积的RSD 分别为1.6%和1.4%。表明仪器精密度良好。

2.4.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，测得黄芪甲苷和芒柄花素峰面积的RSD 分别为0.2%和0.9%，表明样品溶液24 h 内稳定性较好。

2.4.6 耐用性试验 选用3 种不同品牌的色谱柱[色谱柱1：Agilent Zorbax SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;色谱柱2：依利特Hypersil ODS2 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），色谱柱3：Unitary C8色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）]，分别取“2.4.1.2”项下的供试品溶液，按“2.4.2”项下的色谱条件进样检测，均能达到系统适用性试验要求。

2.4.7 重复性试验 取同一批号生血方样品适量，共6 份，分别按“2.4.1.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样，记录黄芪甲苷和芒柄花素峰面积，根据外标法，计算6 份样品中各自所含的黄芪甲苷和芒柄花素的含量，测得黄芪甲苷和芒柄花素的含量分别为0.683 mg·g-1和0.477 mg·g-1，RSD 分别为0.3%和1.1%。表明该方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验 取已知含量的生血方9份，每份1.5g，精密称定，按“2.4.1.2”项下方法制备供试液，精密加入低、中、高混合对照品溶液，平行制备9 份样品，按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，记录黄芪甲苷和芒柄花素的峰面积，根据外标法计算平均加样回收率，结果见表2。

表2 回收率试验结果（n=9）

黄芪甲苷和芒柄花素的回收率分别在97.7%～100.1%和97.7%～98.8%，其平均回收率分别为99.1%和98.5%，RSD 分别为0.7%和0.3%。表明该方法的回收率符合要求。

2.4.9 样品含量测定 分别取3 个批号生血方样品适量，按“2.4.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，记录黄芪甲苷和芒柄花素的峰面积，由回归方程计算样品中黄芪甲苷和芒柄花素的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

本试验分别对甲醇/水，乙腈/水两个流动相系统进行考察，得出乙腈/水为系统的流动相分离效果较为理想，供试品溶液中2 个成分有较好的峰形且能完全分离，溶剂噪音水平较低，所得图谱较理想。

生血方是由10 味中药组成，本实验除了对生血方中黄芪、女贞子、当归进行定性鉴定，以及对黄芪甲苷、芒柄花素2 种成分进行定量测定外，还针对黄精、山药等其余7 种中药进行了薄层鉴别，尝试不同极性展开系统和显色剂的效用，均未能获得满意结果，存在未见相同特征斑点、阴性样品干扰等问题，故未将该部分纳入质控研究中。

黄芪中的活性成分黄芪甲苷为皂苷类，芒柄花素为黄酮类，本试验通过建立HPLC-ELSD 法同时检测2 个成分含量的方法，为控制生血方质量提供了试验基础。