芒柄花素对兔离体肠平滑肌舒张作用的影响

贾晓宁 李家栋 邵正威 王巧云

(滨州医学院口腔学院，山东 烟台 264000)

芒柄花素属异黄酮类化合物。研究证明黄芪中的黄酮类成分有增强免疫、抗心肌缺血、保肝、抗炎、抗突变、清除自由基等药理作用〔1〕，而芒柄花素也可以在一定程度上降低高脂血症金黄地鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)；改善肝脂肪化、减轻炎性细胞浸润；抑制胸主动脉壁内膜下泡沫细胞形成和中膜平滑肌增生，具有抑制肝脏脂肪沉积和预防动脉粥样硬化的作用〔2～4〕。芒柄花素有植物雌激素的特征，在体内具有雌激素样作用，可用于更年期综合征的防治〔5〕。但芒柄花素对胃肠平滑肌运动功能的影响报道很少。本实验通过离体家兔十二指肠平滑肌灌流方法，观察不同浓度的芒柄花素对离体肠平滑肌收缩活动的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1药品 芒柄花素(南京泽朗医药科技有限公司，纯度为98%，批号ZL20091211)，实验时将芒柄花素用DMSO配成药液备用。

1.2试剂 钌红(RR)、Bay K8644、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)购自Sigma公司；乙酰胆碱(Ach，批号091201，中科院上海生物化学研究所试剂厂)。磷酸组胺(中国科学院上海生物化学研究所)。氯化钡(BaCl2，自贡市张家坝盐华有限公司)。实验用Tyrode′s 液(台式液，g)：氯化钠(NaCl) 8.0，氯化钙(CaCl2) 0.2，氯化钾(KCl) 0.2，氧化镁(MgCl2) 0.1，NaHCO31.0，KH2PO40.05，葡萄糖1.0。无钙Tyrode′s 液以EDTA代替CaCl2外，其余成分相同。

1.3动物 家兔 (2.5±0.4)kg，雌雄兼用(由本院动物中心提供)。

1.4仪器 BL-420F生物信号处理系统(成都泰盟科技有限公司)，JH-2型肌张力传感器(中国北京航天医学工程研究所产品)。

1.5实验方法

1.5.1家兔离体小肠平滑肌标本的制备 取健康家兔，禁食24 h后，用木槌猛击兔头枕部致死。迅速沿腹正中线切开腹部，取近回盲部小肠20 cm。置于盛有室温Tyrode′s液的烧杯中，洗净肠内容物。将其剪成2～3 cm的肠段作为实验标本。

1.5.2收缩活动的记录方法 将标本的一端固定于L形钩上，置于盛有20 ml Tyrode′s液的平滑肌槽中；另一端连接张力换能器，持续通混合气体(0.95±0.05)CO2，每秒1～2个气泡，温度(37±0.5)℃ ，张力负荷2 g，平衡1 h，待系统稳定后，开始实验。

1.5.3芒柄花素对小肠平滑肌自主收缩活动的影响 待回肠收缩曲线稳定后，累计加入芒柄花素，使终浓度分别达10、20、40、60、80、100 μmol/L，加药间隔时间为5 min，观察芒柄花素对家兔小肠平滑肌自发收缩活动的影响。用区间测量法测量给药前1 min及给药后第5分钟的张力，以给药前的值为100%，按公式计算给药后小肠舒张百分率〔6〕。

1.5.4芒柄花素对Ach、BaCl2及HA所致肠痉挛性收缩的影响 待回肠收缩曲线稳定后，首先给予Ach(0.1 μmol/L)、BaCl2(10 mg/L)或组胺(HA，5 mg/L)，当刺激平滑肌收缩达平台后，再累计加入芒柄花素(终浓度同上)，观察其对Ach、BaCl2或HA刺激所致痉挛性收缩肠平滑肌是否具有舒张作用。

1.5.5芒柄花素对BayK8644、钌红作用的影响 观察芒柄花素60 μmol/L预孵育5 min后对Bay K8644(0.5 μmol/L)、钌红(10 μmol/L)致小肠平滑肌自发收缩活动的影响。对照组采用相等容积的DMSO。

1.5.6芒柄花素对L-NAME作用的影响 待离体肠平滑肌标本收缩活动稳定后， L-NAME(100 μmol/L) 预孵育10 min后再加入芒柄花素60 μmol/L，观察小肠平滑肌收缩活动的变化。

1.6统计学方法 采用SPSS13.0软件，组间差异比较采用单因素方差分析中的LSD方法。

2 结 果

2.1芒柄花素对家兔离体肠平滑肌收缩活动的影响 10～100 μmol/L芒柄花素能够剂量依赖性抑制小肠平滑肌自发性收缩，使舒张作用增强。对HA、Ach以及BaCl2所致肠平滑肌痉挛性收缩亦均有不同程度的抑制作用，但各剂量组作用均强于肠平滑肌自发性收缩(P<0.05或P<0.01)。芒柄花素浓度为100 μmol/L时，对HA痉挛性收缩的抑制率为85.29%；BaCl2次之，抑制率为81.88%；而对Ach引起痉挛性收缩抑制率为73.16%左右，与对HA痉挛性收缩的抑制作用比较，差异有显著性(P<0.05)；但对肠平滑肌自发收缩活动抑制作用较弱，仅为57.84%。见表1，图1。

表1 芒柄花素对家兔离体肠平滑肌收缩活动的影响

2.2芒柄花素对Bay K8644作用的影响 Bay K8644是L型钙离子(Ca2+)通道开放剂，与对照组比较Bay K8644(0.5 μmol/L)使小肠平滑肌自发收缩张力由(1.03±0.03)g增加到(1.27±0.09)g(P<0.01)；而加入芒柄花素(60 μmol/L) 后再加入Bay K8644(0.5 μmol/L)收缩张力降为(0.64±0.1)g(P<0.01，与Bay K8644组比较)。

2.3芒柄花素对RR作用的影响 RR是肌浆网ryanodine受体阻断剂，在台式液中加入RR(10 μmol/L)，其抑制平滑肌细胞肌浆网释放Ca2+，可使小肠平滑肌自发性收缩张力减弱，RR(10 μmol/L)使小肠平滑肌自发收缩张力由(1.02±0.05)g减小到(0.80±0.03)g(P<0.01)；而加入芒柄花素(60 μmol/L)后再加入RR收缩张力为(0.74±0.08)g，与DMSO+钌红组比较无显著性差异(P>0.05)。

2.4芒柄花素对L-NAME作用的影响 L-NAME是一氧化氮合酶抑制剂，L-NAME (100 μmol/L)使小肠平滑肌自发收缩张力由(1.01±0.05)g变为(0.96±0.09)g，无显著影响(P>0.05)；单加入芒柄花素(60 μmol/L)后小肠平滑肌收缩张力降为(0.68±0.14)g，与L-NAME组比较有显著差异(P<0.01)；L-NAME+芒柄花素组使小肠平滑肌收缩张力降为(0.73±0.05)g，与芒柄花素组比较无显著性差异(P>0.05)，说明L-NAME不能够抑制芒柄花素舒张平滑肌的作用。

a～f:10，20，40，60，80，100 μmol/L芒柄花素

3 讨 论

目前研究认为胃肠道上主要存在M胆碱受体、HA受体、5-HT受体及多种胃肠激素等受体。Ach是平滑肌内兴奋传递的化学物质能，激动M胆碱受体，M受体耦联G蛋白(GP)，使胞内第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG)浓度上升，进而引起 Ca2+释放和底物蛋白磷酸化激发平滑肌产生收缩效应。HA是具有多种生理功能的胺类物质。目前已发现3种HA受体，其中能被传统抗组胺药所阻滞的豚鼠平滑肌上的组胺受体被称为H1型组胺受体(H1-R)， HA作用于H1-R使钙通道开放，胞内游离Ca2+浓度升高，促发胃肠道平滑肌收缩〔7〕。而BaCl2是通过释放细胞内的Ca2+而引起肠管平滑肌痉挛〔8〕。本实验结果显示，芒柄花素能剂量依赖性地抑制肠平滑肌的自发性收缩，为进一步观察其收缩作用的受体机制，以Ach、HA或BaCl2引起肠平滑肌痉挛性收缩，结果发现，芒柄花素对痉挛收缩的肠管平滑肌亦具有不同程度的舒张，但对痉挛收缩肠平滑肌的作用明显强于自发性收缩肠平滑肌。

因Ach、HA以及BaCl2引起肠管平滑肌痉挛性收缩，都与肠平滑肌细胞内Ca2+增多有关。故认为芒柄花素抑制三者引起的肠平滑肌收缩作用与降低细胞内Ca2+浓度有关。肠道平滑肌收缩所需的大部分Ca2+是在动作电位发生时从细胞外进入肌细胞内的，小部分来源于肌质网，当胞内Ca2+浓度升高到一定水平时，触发平滑肌收缩〔9〕。为进一步研究芒柄花素对外钙内流和内钙释放的作用，本实验观察了在芒柄花素预处理下L型钙通道(L-Ca2+)的开放剂Bay K8644以及肌浆网ryanodine受体阻断剂钌红对胃肠平滑肌活动影响的变化。

肠平滑肌中主要的钙通道是L-Ca2+，实验中给予小肠平滑肌L型钙通道的开放剂Bay K8644，大量的钙离子通过L-Ca2+进入平滑肌细胞内，使其自发收缩力提高。而给予芒柄花素后，这种效应被明显抑制，由此可以推断芒柄花素可能阻断了L-Ca2+，抑制Bay K8644引起的外钙内流，从而抑制小肠平滑肌的收缩。肌浆网ryanodine受体阻断剂钌红能够抑制肌浆网释放钙离子，使细胞内钙离子浓度降低，小肠平滑肌自发收缩张力降低，而以芒柄花素预孵育后给予钌红，其舒张肠平滑肌作用被抑制，由此推断芒柄花素可能对肌浆网ryanodine受体亦发挥阻断作用，从而抑制内钙释放。

有研究表明〔10〕，NO通过激活平滑肌细胞内的鸟苷酸环化酶，使胞质cGMP浓度升高，胞内Ca2+降低，导致平滑肌舒张。本实验中应用NO合酶抑制剂L-NAME，可以降低组织中NO的浓度，但对肠平滑肌张力无明显影响，与文献报道一致〔11〕。L-NAME预孵育不能抑制芒柄花素舒张肠平滑肌作用，说明芒柄花素对小肠平滑肌的抑制作用可能与NO浓度无关，但对鸟苷酸环化酶有无影响尚待进一步研究。

综上，芒柄花素明显抑制了家兔离体小肠平滑肌的收缩活动，抑制外Ca2+内流和内Ca2+释放是其机制之一，与肠平滑肌NO浓度无关。

4 参考文献

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