MaReCs技术在染色体平衡易位携带者胚胎移植中的应用

宋歌 米冬青 孟繁玉 蒋彦 贾博钦 周晓璞 吴小华

染色体易位在不良孕产史患者中是一种染色体常见的结构异常，是指两条染色单体发生断裂后，相互交换并且重新连接形成两条新的染色体的现象[1]。易位患者的染色体数目和遗传物质通常不发生变化，故对携带者本人在表型上没有太大影响，但是在其向下一代传递过程中会发生错配，容易出现不孕不育、反复流产、反复种植失败和出生缺陷等情况的发生[2,3]。家族遗传和新发突变都可以导致染色体易位的发生，在正常人群中染色体易位的发生率只有2‰左右[4]，但在反复不良孕史夫妇中易位的发生比率接近1/10。如果患者夫妇其中一人作为平衡易位的携带者，那么他们生育的子女发生染色体片段不平衡的比例会大大提高，流产、不孕或出生子女患有先天性缺陷疾病的风险也会增高[5，6]。胚胎植入前遗传学检测技术(perimplation genetic testing,PGT)就是在体外受精-胚胎移植技术(IVF-ET)的基础上[7]，使用全染色体筛查技术，如二代测序等全基因组测序方法对体外受精中形成胚胎的非整倍性进行植入前检测，可实现筛选出平衡的整倍体胚胎，进而可以避免染色体不平衡胚胎植入宫腔，这是现有的应用较多的技术。但是，易位的携带状态与否是我们使用常见的全染色体筛查技术无法确定的[8]，因此不能确保子代完全不携带易位基因。众所周知，在我们进行体外受精过程中，利用现有的方法确定胚胎是否携带染色体易位状态是非常困难的。Xu等[8]建立了一种诊断染色体异常的方法，称为MaReCS技术，该技术借助全基因组扩增和下一代测序技术可以同时对胚胎进行染色体整倍性的筛查和易位携带状态的辨别，它可以为平衡易位携带的患者精确地挑选出不含易位携带的胚胎进行移植。本文报道河北省首例对染色体平衡易位患者应用MaReCS技术，鉴别出不携带易位的胚胎植入子宫后成功妊娠，经过胎儿羊水细胞核型分析印证了该携带状态筛査的准确性，最终分娩出不携带平衡易位的健康新生儿，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 患者，女，28岁，因原发不孕6年，子宫肌壁间多发肌瘤，两侧输卵管通畅欠佳，男方少弱畸精子症来我中心就诊，男方染色体 46，XY，t(12；22)(q13；q13)。患者夫妇双方在经过充分的遗传咨询后，要求选择PGT助孕并签署PGT知情同意书。

1.2 胚胎培养与活检样本采集 患者于2019年2月采用卵泡期超长方案进行降调节，Gn用量HMG 2 675 U，人绒毛膜促性腺激素10 000 U注射后36 h取卵，获卵13枚，MⅡ卵子12枚，取卵日采用卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)进行授精，2PN 12枚，之后采用G系列序贯培养系统在在37℃三气培养箱(5%CO2，5%O2和90%N2)中进行胚胎培养，受精后第5、6天胚胎培养至囊胚阶段，通过观察胚胎和囊胚评分，发现共形成2枚可利用囊胚，囊胚评分级别是4BC×2，用激光法对这2枚囊胚进行滋养外胚层活检，每枚囊胚活检3～5个细胞，活检后的囊胚逐一进行玻璃化冷冻，于液氮罐中保存。经检测该2枚囊胚均为异常胚胎，因本周期胚胎中无染色体拷贝数正常(46，XN)的样本，无法进行下一步胚胎染色体易位携带检测。遂患者于2019年4月再次行ICSI助孕，采用拮抗剂方案，获卵17枚，受精11枚，形成3枚囊胚，经活检后检测1枚胚胎未见染色体拷贝数异常。患者在充分知情同意后，选择应用MaReCs技术对该枚平衡胚胎的易位状态做进一步的区分，结果此枚胚胎不携带平衡易位。患者经过充分遗传咨询后，于2019年11月选择该未携带易位的且不存在拷贝数变异的4BC囊胚进行解冻复苏移植，14 d后测检测血HCG 1 709 U/L，28 d后B超观察到孕囊，可确认获得了临床妊娠；患者在孕周22+5时羊水穿刺获得胎儿羊水细胞，产前诊断的方法是高通量DNA测序，同时STR连锁分析进行检测基因组拷贝数变异(CNVs)，结果显示该样本未检出染色体非整倍体或>100 kb已知、明确致病的CNVs。应用G显带方法对患者胎儿羊水细胞进行染色体核型检测，发现胎儿羊水细胞染色体检查未见数目及结构异常，这也进一步验证了PGT结果的准确性。

1.3 MaReCS检测

1.3.1 第一阶段：活检细胞放入样本保存管，使用基于 MALBAC 原理改良的基因测序通用样本处理试剂盒(XK-028，Yikongenomics)进行全基因组扩增，构建文库并进行高通量测序(next generation sequencing，NGS)[9-11]，使用Illumina Nextseq550测序平台，每个样品产生3～5 M读长(reads)的数据量，从测序结果中去除测序接头和低质量碱基后，分析每个样品的 CNVs，参考Li等[11]进行生物信息学分析并结合胚胎情况明确断裂位点，精确±200 kb。

1.3.2 第二阶段：采集男女双方外周血，采用通用型柱式基因组提取试剂盒(CW2298M，cwbio)。于断点上下游3M范围内设计单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，采用多重PCR方法扩增，并构建文库，经高通量测序，数据经分析后构建SNP单体型。

1.4 产前诊断 采用高通量测序检测CNVs，采用羊水细胞染色体核型分析胎儿染色体数目和结构异常。

1.5 临床结局跟踪 在患者移植术后随访跟踪显示，术后14 d，血HCG 1 709.64 U/L；术后21 d，血HCG 15 000 U/L；术后28 d，在B超下观察到孕囊26.3 mm；孕22+5周时，羊水穿刺获得胎儿羊水细胞；患者于2020年7月于我院产科顺利分娩出一男婴，体重3 920 g，健康状况良好。

2 结果

2.1 MaReCS检测结果

2.1.1 第一阶段检测结果：患者2个周期，共5个囊胚活检样本：其中1个样本未见染色体拷贝数异常，4个样本染色体拷贝数异常；根据901和902样本，分析断裂点位置：chr12:51,900,(001±200)k；chr22:48,900,(001±200)k。见表1。

表1 活检样本的CNV结果

2.1.2 第二阶段检测结果：通过家系样本构建SNP单体型，进一步区分出903未见拷贝数异常的胚胎是不携带平衡易位的。903染色体易位携带检测结果。见表2。

表2 0903样本的MaReCs检测结果

2.2 胎儿羊水细胞产前诊断检测

2.2.1 胎儿羊水高通量测序检测结果：该样本未检出染色体非整倍体或100 kb以上已知、明确致病的基因组拷贝数变异(CNVs)。见图1。

图1 胎儿羊水细胞CNV图

2.2.2 胎儿羊水细胞染色体核型分析结果：46，XN，未见数目及结构异常。见图2。

图2 胎儿羊水细胞染色体核型

3 讨论

据报道，河北省平均每100个出生婴儿中就会出现1个出生缺陷儿[12]。河北省作为人口大省和出生缺陷高发地区之一，该技术的应用在降低出生缺陷，提高人口质量方面尤为重要。

近年来，不良孕产史疾病中复发性流产和胚胎停育较为常见，造成流产或胎停的重要原因之一就是染色体易位[13]。众所周知，通过PGT技术可以筛选出平衡的整倍体胚胎，进而可以避免染色体不平衡胚胎植入宫腔所造成的反复流产或种植失败的发生。不同检测方法的运用，直接影响了PGT检测结果的准确性[14]。众所周知，在我们进行体外受精过程中，利用现有的方法确定胚胎是否携带染色体易位状态是非常困难的。那么，如何保证染色体易位携带者能够生出完全健康的孩子一直以来都是学者研究讨论的难题[7]。MaReCS[11]技术，作为一种新型的PGT技术，它将MALBAC全基因组扩增技术与NGS技术相结合，分为2个阶段，首先活检细胞经过MALBAC-lab技术扩增后，进行高通量测序，构建文库、测序后得到染色体CNVs，区分染色体拷贝数正常和异常的胚胎，经过生物信息学分析，明确易位断裂点；其次易位断点识别出之后进而进行SNP连锁分析，我们通过查找SNP位点，设计SNP位点引物，构建单倍型，方能区分出正常胚胎与平衡易位携带胚胎，从而阻止染色体平衡易位向下一代的传递。该技术借助全基因组扩增和下一代测序技术可以同时对胚胎进行染色体整倍性的筛查和易位携带状态的辨别，它可以为平衡易位携带的患者精确地挑选出不含易位携带的胚胎进行移植。

在本文病例中，患者双方在PGT之前进行了详细的遗传咨询，充分了解该技术存在的局限性及风险后，自愿选择PGT，并签署知情同意书，移植1枚非易位携带的胚胎并成功妊娠，孕期做胎儿羊水穿刺后检测胎儿羊水细胞染色体检查未见数目及结构异常。有学者此前报道，应用MAReCs技术能够区分胚胎的染色体易位携带状态，30个平衡胚胎被成功区分为21个正常胚胎和9个易位携带胚胎，使得易位不再向子代传递[15]，这与我们的病例报道相符。该项技术做为河北省首次尝试应用MaReCs技术筛选出没有发生平衡易位的胚胎，植入子宫后成功妊娠，经过羊水核型分析验证了该携带状态筛查的准确性，最终分娩出不携带平衡易位的健康新生儿，截止发稿时其生长发育各项指标均正常，我们这个病例成功有效的阻止了染色体平衡易位向下一代的传递，是河北省MaReCs技术的首位获益者，填补了河北省PGT技术相关技术领域的空白。

MaReCs技术不需要做预实验，操作也并不复杂，其实用性在于只需要采集夫妻血样就可以完成鉴定出胚胎的易位携带状态，而且无论易位是否是遗传的还是患者新发突变，都可以对胚胎进行区分。但是MaReCs技术的缺点是要求患者有多枚胚胎参与检测，如果检测出所有胚胎均是平衡胚胎或有非平衡胚胎但我们没有办法判断出其断裂位点时，没有参照胚胎就没有办法进行第二步的检测。因为需要找出参照胚胎才能找出断裂位点，该实验才能往下继续进行。我们中心在之前的平衡易位携带者进行的PGT周期中，就是因无法找到参考胚胎，所以无法进行MaReCs第二阶段的测定，所以只是帮助患者找到平衡胚胎进行复苏移植，不能确定移植的胚胎是否携带有平衡易位。但是一旦找到参照胚胎，就能够使易位患者生育完全健康的孩子，且不影响子代的生育问题，这方面的意义是及其重大的。因此，我们有理由期待MaReCS技术将会帮助减少平衡易位和罗氏易位在人群中的传递。此外，除了平衡易位，目前我中心还将MaReCs技术应用在罗氏易位和染色体臂间倒位的病例中，它能有效避免因平衡易位携带而导致流产以及流产给患者带来的创伤，为河北省优生优育做出了相应的贡献，也为PGT技术在我省的推广起到了重要作用。