RapidWarm Blast玻璃化解冻液对囊胚复苏的效果观察

陈蓓丽 王凯娟 丁方方 丁 丁 邹慧娟 纪冬梅 章志国

理想的胚胎冻融技术是人类生育力保存以及提高体外受精-胚胎移植周期累积妊娠率的保障，简洁、快速、高效玻璃化冻融技术目前已在全世界范围内广泛开展。选择最合适的玻璃化冷冻与解冻液是实现高效胚胎冻融、保障患者成功妊娠的重要前提条件。Vitrification Media解冻液是目前临床最常用的胚胎玻璃化解冻液，其胚胎复苏后存活率高，复苏移植临床妊娠率稳定[1]。RapidWarm Blast解冻液是国外近年新研发的一种胚胎玻璃化解冻液，主要用于复苏玻璃化冷冻的囊胚(体外培养发育至第5天或第6天的胚胎)，目前国内中心应用较少，且其复苏效果相关研究报道少见。本文通过比较Vitrification Media与RapidWarm Blast玻璃化解冻液的囊胚复苏效果及临床妊娠结局，评估RapidWarm Blast玻璃化解冻液的临床效果，为囊胚复苏过程中解冻液的选择和使用提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年12月至2019年12月在安徽医科大学第一附属医院生殖中心行首次囊胚解冻移植的655例患者临床资料，根据使用囊胚解冻液的不同分为A组(357例)、B组(298例)，A组使用Vitrification Media解冻试剂盒(KITAZATO，Japan)进行囊胚复苏，B组使用RapidWarm Blast解冻试剂盒(Vitrolife，Sweden)进行囊胚复苏。纳入标准：符合《不孕症诊断指南》[2]：未采取避孕措施，有规律性生活至少12个月未能获得临床妊娠的患者夫妇；纳入本研究的所有不孕症患者皆在新鲜取卵周期通过全囊胚培养方式获得囊胚，同时使用KITAZATO玻璃化冷冻液行全胚胎冷冻；纳入本研究的周期均为首次囊胚解冻移植周期。排除标准：卵裂期胚胎(即体外培养发育至第3天的胚胎)解冻移植周期及再次胚胎解冻移植周期均不纳入本研究范围。两组患者年龄、移植囊胚数、不孕类型、内膜方案、移植胚胎数目等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 囊胚玻璃化冷冻 采用Vitrification Media冷冻试剂盒(KITAZATO，Japan)，冷冻前室温下复温1小时。取四孔皿，标记患者姓名，加入平衡液和冷冻液各400 μL。冻前将扩张囊胚行激光打孔预处理，待囊胚皱缩后尽快行玻璃化冷冻：将皱缩囊胚移入平衡液，室温放置5 min；然后再将囊胚转移至玻璃化冷冻液中来回吹吸，1 min内装管。装载后的载杆迅速投入液氮，同时在液氮液面以下套上载杆外套管，置液氮罐长期保存。

1.2.2 囊胚复苏 囊胚复苏前准备:拉制适合囊胚大小口径的巴斯德移液管,调整计时器,预先从液氮罐中找出需要解冻的胚胎，置于盛有液氮的小容器内，靠近体式显微镜放置；根据不同解冻试剂盒要求，加液同时进行预热：A组Vitrification Media解冻试剂盒包含TS、DS、WS1、WS2四种液，向Falcon 353037皿中加入TS液500 μL，37℃预热，余下三种液依次添加至Thermo 14444四孔皿中，各500 μL，室温使用；B组RapidWarm Blast解冻试剂盒包含Warm 1TMBlast、Warm 2TMBlast、Warm 3TMBlast三种液，向Falcon 353037皿中加入Warm 1TMBlast液500 μL，余下两种液依次添加至Thermo 14444四孔皿中各500 μL，所有液均置于37℃预热待用。

囊胚复苏过程:A组，用镊子将装有囊胚的冷冻载杆在液氮下脱去套管，并立即从液氮中取出，将载杆前端全部浸入37℃预热的TS液中。反复洗涤后，1 min内转移至DS液中，让其自液体表面自然下落，停留3 min，再依次转入WS1、WS2液中，分别停留5 min，最后移入囊胚培养液中(COOK，Australia)。B组：复苏后立即将囊胚转移到Warm 1TMBlast液中，使囊胚从冷冻载体掉落并沉入到溶液底部，停留2 min；再依次转入Warm 2TMBlast、Warm 3TMBlast液中，分别停留3、5 min，最后移入囊胚培养液中。在不同浓度的解冻液转移过程中要注意尽量少的带入上一步液，同时可用下一步液清洗巴斯德移液管2～3次，以减少上一步液的影响。复苏囊胚行激光辅助孵化后，置于37℃ COOK桌面培养箱培养2 h后进行移植。

1.2.3 妊娠结局判定 囊胚移植后第14天，检测患者血或尿人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)，当血HCG>5 IU/L或尿HCG阳性判定为生化妊娠；阳性者移植后第30天行阴道超声检查，B超下见到孕囊及原始心管搏动为临床妊娠。种植率为着床胚胎数占移植胚胎总数的百分比。

1.3 观察指标 比较两组囊胚复苏后整体存活率、解冻2 h后重扩张率、孵化率、囊胚种植率及临床妊娠率；同时比较两种解冻液对囊胚不同发育阶段(第5天、第6天)的重扩张率、孵化率及临床妊娠率的影响。

2 结果

2.1 两组囊胚复苏后的重扩张率及孵化率比较 两组囊胚复苏后的存活率、2 h重扩张率、2 h孵化率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组囊胚复苏后的重扩张率与孵化率比较[个(%)]

2.2 两组发育第5天、第6天囊胚复苏后的重扩张率与孵化率比较 B组第6天囊胚复苏后的重扩张率与孵化率均高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)；两组第5天囊胚复苏情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组第5天囊胚扩张率及孵化率均高于第6天的囊胚，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组发育第5、6天囊胚复苏后的重扩张率与孵化率比较[个(%)]

2.3 两组患者临床妊娠结局比较 B组解冻后的囊胚种植率高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组临床妊娠率差异无统计学意义(P>0.05)。两组移植第5天复苏囊胚的临床妊娠率均高于第6天的复苏囊胚，差异有统计学意义(P<0.05)。B组移植第6天复苏囊胚的临床妊娠率高于A组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 两组患者临床妊娠结局比较(%)

3 讨论

胚胎冷冻保存是辅助生殖技术治疗不孕症的重要手段之一。自1998年Mukaida等[3]首次采用玻璃化技术冻存人类胚胎并复苏移植获得成功后，目前已形成了商品化统一规格的玻璃化冷冻及解冻试剂盒，Vitrification Media玻璃化解冻液因其胚胎复苏后存活率高，复苏移植临床妊娠率稳定，而在临床广泛应用[1]。RapidWarm Blast玻璃化解冻液是国外新近研发的一种囊胚解冻液，其中冷冻保护剂的配比及复苏步骤与Vitrification Media有所不同，其对囊胚复苏效果的评估鲜有报道。本文回顾性分析在本中心进行首次囊胚复苏移植患者的临床资料，以评估RapidWarm Blast玻璃化解冻液对囊胚的复苏效果，为临床上囊胚玻璃化解冻液的选择和使用提供一定参考。

本研究结果显示，两组囊胚解冻后的存活率，复苏2 h后的囊胚重扩张率及孵化率差异均无统计学意义(P>0.05)，表明RapidWarm Blast解冻液对囊胚的复苏效果与Vitrification Media解冻液相似。囊胚复苏后1～2 h使用显微镜观察囊胚形态，通过细胞的折光性、透明带的完整性以判断囊胚的存活状况。囊胚扩张与孵出后才能更好的粘附侵入子宫内膜，因此囊胚腔的扩张与孵化状态是衡量囊胚活力，影响胚胎着床率及临床妊娠率的重要因素[4-6]。本研究结果显示两种解冻液对囊胚复苏效果相同，均能保证囊胚从低温状态中高效安全的复苏并具备较好的后续发育潜能。

本研究还比较了两种解冻液对不同发育阶段囊胚的复苏效果，发现两组发育第5天囊胚的复苏效果均明显优于发育第6天的囊胚(P<0.05)；两种解冻液之间对发育第5天囊胚的复苏效果差异不显著，但RapidWarm Blast解冻液在复苏发育第6天的囊胚时，较Vitrification Media解冻液表现出一定优势，B组囊胚扩张率及孵化率均高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。两种解冻试剂盒的解冻原理是一致的，主要的区别在于冷冻保护剂的配制比例和复苏时对操作温度的要求不同。有研究[7]表明玻璃化后胚胎的存活能力严格取决于细胞脱水的程度和复苏时升温的速率，而并非取决于所用冷冻保护剂的类型和浓度。Jin等[7]研究显示，仅使用非渗透性冷冻保护剂和相对较慢的冷却速度，但在复苏过程中使用超快速升温获得了小鼠卵母细胞和胚胎的高冷冻存活率。本研究中RapidWarm Blast解冻液复苏囊胚的所有操作均在37℃热台完成，而Vitrification Media解冻液组仅第一步平衡时置于37℃下操作，其余步骤均于室内常温下完成。维持较快而稳定的升温速度可以帮助胚胎很快通过-120℃到-35℃的危险阶段，从而避免重结晶对囊胚的损伤而影响后续的发育能力[8-9]，这可能是RapidWarm Blast解冻液在复苏第6天囊胚表现出优势的本质原因。

本研究还显示，移植发育第5天复苏囊胚较第6天囊胚临床妊娠率高，这个结论与大部分研究[10-12]结果一致。对临床资料的系统评价和荟萃分析[11]显示，在新鲜和冷冻复苏移植周期中，发育第5天囊胚移植的临床妊娠率和活产率值均高于第6天囊胚。何丽娟等[13]发现胚胎发育天数影响冻融胚胎移植成功率，胚胎发育至第5天囊胚更有利于胚胎着床，提高临床妊娠率，降低流产以及异位妊娠发生率。第6天囊胚发育慢于第5天囊胚，其在体外培养时间长，发育过程中DNA等遗传物质损失多，冷冻过程中抗冻能力差，复苏后囊胚质量及发育潜能容易受到损伤，因此导致移植第6天复苏囊胚临床妊娠率低于第5天囊胚[11]。本研究对复苏后的囊胚未进行具体分级，因此无法排除囊胚本身质量的影响，需要进行大样本的随机对照研究进一步验证本结果。

综上所述，新型RapidWarm Blast玻璃化解冻液用于囊胚复苏可获得与传统的Vitrification Media相似的胚胎发育与临床妊娠结局，但RapidWarm Blast对发育第6天囊胚的复苏效果更好，胚胎种植率更高，行发育第6天囊胚解冻移植时可考虑使用。