LINC00511调控NF-κB通路对多囊卵巢综合征卵巢颗粒细胞凋亡和炎性反应的影响

卫玲 张燕 陈晓娟

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄女性最常见的内分泌疾病，主要表现为雄激素分泌过多、窦卵泡生长停滞和慢性炎症，其严重影响患者的生理和心理健康[1]。PCOS进展可能涉及遗传、内分泌、代谢等多种因素，但其确切发病机制仍不清楚[2]。卵巢颗粒细胞是卵泡中最重要的体细胞，可合成多种激素及生长因子，参与调控卵泡发育，而颗粒细胞异常凋亡、炎性反应可诱导PCOS病理进程[3,4]。因此，研究卵巢颗粒细凋亡机制、抑制细胞炎性反应对指导PCOS的临床治疗至关重要。长链非编码RNA(lncRNA)是长度>200 nt的RNA转录本，特定lncRNA的表达增加或缺失均可引起细胞基本活动异常，导致疾病进展。LINC00511是近年发现的致癌lncRNA，有研究报道其表达上调与宫颈癌的恶性状态有关，并可促进癌细胞的增殖和转移[5]。LINC00511还能促进乳腺癌细胞干性和肿瘤形成，其高表达提示乳腺癌患者预后不良[6]。然而，笔者查阅文献后发现LINC00511在PCOS中的功能尚不清楚。本研究分析LINC00511对PCOS卵巢颗粒细胞凋亡以及炎性因子表达的影响，以期为PCOS治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人正常卵巢上皮细胞IOSE-80购自上海赛百慷生物公司；人卵巢颗粒细胞KGN购自深圳华拓生物科公司；PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq II试剂盒、TRIzol试剂购自大连takara公司；si-LINC00511、si-NC、pcDNA-LINC00511、pcDNA购自上海汉恒生物公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin-V-FITC)凋亡检测试剂盒购自南京碧波生物科技公司；人白细胞介素1β(IL-1β)酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒、人IL-6 ELISA检测试剂盒、兔源剪切型半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)单克隆抗体(AC033)、兔源β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(AF5003)购自上海碧云天生物公司；磷酸化核因子κB(p-NF-κBp65，p-p65)单克隆抗体购自上海钰博生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：IOSE-80细胞、KGN细胞分别采用RPMI-1640、DMEM培养基培养，培养基中均添加10%胎牛血清和1%青链霉素双抗，置于含95%空气、5%二氧化碳、37℃、80%湿度的温箱孵育。当细胞长至培养瓶>90%时1∶3传代。

1.2.2 RT-qPCR检测LINC00511表达：TRIzol法提取KGN细胞和IOSE-80细胞的总RNA，用PrimeScript逆转录试剂盒将1 μg总RNA逆转录为cDNA，再用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行RT-qPCR。LINC00511表达归一化为β-actin，用2-ΔΔCt法计算LINC00511表达量。引物序列为LINC00511上游5’-CTAACAAGAGGGTAAGTGTCAG-3’，LINC00511下游5’-AAGTCGACAACCCCATCGTTAC-3’；β-actin上游5’-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3’，β-actin下游5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3’。

1.2.3 实验分组：将对数期KGN细胞按2×104个/孔的密度接种24孔板，当细胞长至培养板底部的50%，用lipofectamine 2000将50 nmol/L si-LINC00511、50 nmol/L si-NC、2 μg pcDNA-LINC00511、2 μg pcDNA转染KGN细胞。转染48 h收集细胞，RT-qPCR检测LINC00511表达以验证抑制或过表达效果。转染si-LINC00511、si-NC、pcDNA-LINC00511、pcDNA的KGN细胞分别记为si-LINC00511组、si-NC组、pcDNA-LINC00511组、pcDNA组；用20 ng/ml的TNF-α[7]孵育转染si-LINC00511细胞24 h记为si-LINC00511+TNF-α组。每次检测设置3个复孔，实验独立重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡：PBS洗涤各组KGN细胞2次，加入适量1×结合缓冲液重悬细胞。吸取500 μl细胞悬液，依次加入5 μl Annexin-V-FITC和5 μl碘化丙啶，室温避光孵育15 min。流式细胞仪分析各组KGN细胞凋亡情况。

1.2.5 ELISA法检测细胞培养液中IL-6和IL-1β水平：细胞培养结束后，3 000 r/min离心10 min，收集细胞培养液上清，参照商品试剂盒说明书步骤检测IL-6和IL-1β表达水平。

1.2.6 Western blot检测Cleaved-caspase-3和p-p65蛋白表达：RIPA法提取各组KGN细胞总蛋白，每组取30 μg变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压100 V，时间100 min)，然后电转(20 mA，时间12 h)至硝酸纤维素膜。加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再与Cleaved-caspase-3(1∶2 000稀释)、β-actin(1∶3 000稀释)、p-p65(1∶1 000稀释)的一抗4℃摇床孵育10 h。随后加入1∶2 500稀释的酶标二抗，室温孵育2 h。加入化学发光试剂检测蛋白。Image J软件分析各条带相对于β-actin条带灰度值以表示其蛋白表达量。

2 结果

2.1 DCOS卵巢颗粒细胞中LINC00511表达情况 与IOSE-802组细胞表达(1.00±0.10)比较，KGN细胞中LINC00511表达水平(2.41±0.04)显著升高(P<0.05)。

2.2 LINC00511对KGN细胞凋亡的影响 si-LINC00511组KGN细胞LINC00511表达水平显著低于si-NC组(P<0.05)，表明转染si-LINC00511可抑制LINC00511表达。pcDNA-LINC00511组KGN细胞LINC00511表达水平显著高于pcDNA组(P<0.05)，表明转染pcDNA-LINC00511可促进LINC00511表达。与si-NC组比较，si-LINC00511组KGN细胞Cleaved-caspase-3蛋白表达、凋亡率显著升高(P<0.05)；与pcDNA组比较，pcDNA-LINC00511组KGN细胞Cleaved-caspase-3蛋白表达、凋亡率显著降低(P<0.05)。见图1，表1。

图1 LINC00511对KGN细胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响;A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B Western Blot检测Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表1 LINC00511对KGN细胞凋亡的影响

2.3 LINC00511对KGN细胞炎性因子表达的影响 与si-NC组比较，si-LINC00511组KGN细胞培养液中IL-6和IL-1β水平显著降低(P<0.05)；与pcDNA组比较，pcDNA-LINC00511组KGN细胞培养液中IL-6和IL-1β水平显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 LINC00511对KGN细胞炎性因子表达的影响

2.4 LINC00511对KGN细胞中NF-κB信号通路蛋白表达的影响 与si-NC组比较，si-LINC00511组KGN细胞p-p65蛋白表达显著降低(P<0.05)；与pcDNA组比较，pcDNA-LINC00511组KGN细胞p-p65蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表3，图2。

图2 Western Blot检测p-p65蛋白的表达

表3 LINC00511对KGN细胞NF-κB信号通路蛋白表达的影响

2.5 TNF-α可以逆转干扰LINC00511表达对KGN细胞凋亡以及炎性反应的影响 与si-LINC00511组比较，si-LINC00511+TNF-α组KGN细胞LINC00511表达水平、p-p65蛋白表达显著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表达、凋亡率显著降低，细胞培养液中IL-6和IL-1β水平显著升高(P<0.05)。见图3，表4。

图3 TNF-α可以逆转si-LINC00511对KGN细胞凋亡以及细胞炎性反应的影响；A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B Western Blot检测p-p65、Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表4 TNF-α可以逆转si-LINC00511对KGN细胞凋亡以及细胞炎性反应的影响

3 讨论

lncRNA是重要的基因表达调节因子，其表达异常与雄激素分泌、胰岛素抵抗、卵泡发育、排卵等PCOS进展的多个环节密切相关，可能是PCOS治疗的潜在靶标[8]。此外，研究证实lncRNA还可通过影响颗粒细胞增殖和凋亡在PCOS中发挥作用[9,10]。LINC00511已被报道在多种癌症中发挥功能，研究显示LINC00511表达水平与肝癌患者TNM分期、淋巴转移相关，LINC00511高表达提示肝癌患者预后不良[11]。胃癌中LINC00511表达增加，敲减LINC00511可抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡[12]。LINC00511过表达可增强食管癌细胞增殖能力，促进细胞周期进展，抑制细胞凋亡[13]。此外，敲减LINC00511通过调控细胞恶性行为对宫颈癌、肾透明细胞癌、肺腺癌进展均有抑制作用[14，15]。本研究检测到PCOS卵巢颗粒细胞KGN中LINC00511表达增加，提示LINC00511可能在PCOS进展中发挥调节因子作用。为探讨LINC00511对KGN细胞功能的影响，本研究分别转染si-LINC00511、pcDNA-LINC00511至KGN细胞，结果显示干扰LINC00511表达可诱导细胞凋亡，并上调促凋亡Cleaved-caspase-3蛋白表达，而过表达则具有相反作用，这与之前研究报道[12]相似。

PCOS的发展通常伴随着慢性炎症，主要表现为IL-6、IL-1β等促炎因子产生增加，这些促炎因子的失调可能损害卵泡发育和成熟[16]。本研究显示干扰LINC00511表达降低IL-6和IL-1β水平，而过表达LINC00511则增加IL-6和IL-1β水平，这表明干扰LINC00511表达可抑制KGN细胞炎性反应。NF-κB是炎症过程的关键介质，正常情况下NF-κB可与细胞质中的IκB形成无活性复合物，当受到刺激后NF-κB易位到细胞核，调节炎性因子基因表达。研究表明，加味芍药甘草汤可抑制NF-κB通路活化来调节局PCOS大鼠卵巢部炎性反应，进而改善卵巢功能[17]。此外，lncRNA类固醇受体RNA激活剂(SRA)对NF-κB通路亦具有调控功能，沉默lncRNA SRA能够抑制NF-κB核转位，抑制PCOS小鼠卵巢颗粒细胞促炎细胞因子分泌，减轻卵巢损伤[18]。本研究显示，干扰LINC00511表达可抑制p65的磷酸化，过表达可促进p65的磷酸化，表明干扰LINC00511表达可抑制NF-κB通路活化。有报道称NF-κB可能通过激活Caspase-3表达来诱导PCOS卵巢颗粒细胞凋亡[19]。本研究发现，采用TNF-α激活NF-κB通路可拮抗干扰LINC00511表达对KGN细胞凋亡、IL-6和IL-1β水平、Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响，这进一步表明干扰LINC00511通过抑制NF-κB通路参与调控PCOS卵巢颗粒细胞凋亡和炎性反应。

综上所述，干扰LINC00511通过抑制NF-κB通路从而诱导PCOS卵巢颗粒细胞凋亡，抑制炎性反应，这些发现可能为PCOS提供潜在治疗靶点。