基于网络药理学探讨络风宁3号方治疗心律失常的作用机制

马梁，王保福，王显,2

心律失常属于中医“心悸”的范畴，指心脏电生理冲动在产生或传导过程中发生异常，以心慌、胸闷、乏力，甚至晕厥为临床表现的心律、心率异常的疾病。长期心律失常可引起心力衰竭、心肌梗死、脑卒中等疾病，严重危害个人生存质量[1]。因此，如何发挥中医药对心律失常的防治作用一直是中医药研究亟待解决的问题。王显教授结合络病学理论[2]认为，“络风内动”为心律失常重要发病机制之一，多因内外风邪扰动心之络脉，进而气血紊乱，导致心悸发作；且心悸起病急骤、发病时间不定、病情变化迅速等临床表现与中医“风邪”的致病特征类似，故创立络风宁3号方从风论治心律失常。课题组前期研究发现，络风宁3号方可显著降低心律失常发生率[3,4]，其中治疗房颤总体有效率达81%[4]，治疗室早总体有效率达77.5%[3]，但其作用机制尚未阐明。本文通过“网络药理学”，分析络风宁3号方治疗心律失常的有效成分和相关靶点通路，为络风宁3号方的临床应用和后续基础研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 络风宁3号方化学成分的筛选在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中搜索络风宁3号方部分中药的有效成分（徐长卿、柴胡、黄芩、半夏、人参、五味子、三七、茯苓）。TCMSP数据库未收录的药物，则在ETCM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM/）（麦冬、石菖蒲）和DrugBank数据库（https://go.drugbank.com/）（生龙齿）进行检索。以上三种数据库均未收集茯神，查阅文献[5]发现茯神与茯苓在相关成分上并无明显差异，两者之间存在的差异主要为有效成分含量不同，故在TCMSP数据库中以“茯苓”代替“茯神”进行检索。参照药代动力学（ADME），以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为筛选标准进行筛选。将得到的有效成分统一在TCMSP数据库中进行靶点基因预测，并通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）对获得的靶点名称进行规范校正。将“药物”、“化合物”、“靶点”相关信息导入Excel，整合重复的有效成分。

1.2 心律失常潜在靶点预测以“Arrhythmia”作为关键词，在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中对“心律失常”发病相关的靶基因进行检索并根据相关性进行筛选。用 R语言获取疾病靶点基因与络风宁3号方作用靶点的交集，并绘制韦恩图。

1.3 络风宁3号方中核心成分与核心靶点筛选通过Cytoscape3.7.2[6]软件绘制“药物-靶点”网络，将筛选出来的中药化合物所对应靶点与心律失常相关靶点进行映射；使用Network Analyze插件分析网络图，比较网络中各节点度值（Degree Centrality）、紧密中心性（Closeness Centrality），筛选出核心成分与靶点基因。

1.4 蛋白互作（PPI）网络的构建与分析以络风宁3号方与心律失常的交集靶点为输入内容，在STRING11.0数据库（https://www.string-db.org/）中进行蛋白互作分析，选择“种属”为“Homo Sapiens”，设定相互作用评分（minimum required interaction score）为0.4，得到PPI网络图，并导入Cytoscape3.7.2软件中，利用Network Analyze进行分析，筛选出核心靶点蛋白。

1.5 基因功能富集（GO）分析及生物通路（KEGG）分析利用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）将1.2得到的交集靶点进行GO和KEGG富集分析，分别从细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）对这些交集靶点的功能进行GO富集分析并利用R语言ggplot2绘制柱状图。KEGG富集分析结果根据P（Pvalue）值与基因比例（GeneRatio）值，利用R语言ggplot2绘制前20位柱状图及气泡图，进行可视化研究。

2 结果

2.1 络风宁3号方中化学成分的筛选共获得络风宁3号方有效活性成分1257种。其中，TCMSP数据库中检索到徐长卿有效成分68种、石菖蒲17种、柴胡349种、黄芩143种、半夏116种、人参190种、五味子130种、三七119种、茯神34种。在ETCM数据库中检索到石菖蒲有效成分17种、麦冬52种。在DrugBank数据库中检索到生龙齿有效成分22种。将这些化学成分进行整合分析，按照OB和DL值进行筛选，删除重复值，共得到120种有效成分，其中徐长卿6种，石菖蒲4种，柴胡17种，黄芩36种，半夏13种，人参17种，麦冬4种，五味子8种，三七8种，茯神6种，生龙齿1种。部分有效成分的基本信息见表1。

表1 络风宁3号方中部分有效成分的基本信息

2.2 预测络风宁3号方治疗心律失常的核心作用靶点在TCMSP数据库中获得络风宁3号方共239个靶点基因。GeneCard数据库获得“心律失常”潜在靶点4035个，根据相关性（Relevance score），两次取中位数后共筛选出1091个潜在靶点。如图1所示，共获得“络风宁3号方”和“心律失常”交集靶点82个。

图1 络风宁3号方治疗心律失常靶点Venn图

2.3 络风宁3号方“成分-靶点-疾病”网络绘制和分析通过Cytoscape3.7.2软件绘制“成分-靶点-疾病”网络图，共有157个节点（82个基因靶点，75个有效成分节点），495条连线，结果见图2。利用Network Analyze工具进行拓扑分析，筛选出核心靶点基因与主要活性成分。网络中平均每个活性成分和7个核心靶点相互关联；平均每个核心靶点基因与6个活性化合物相互作用，表明络风宁3号方中各个有效成分之间存在协同调控，相互关联的作用。根据Closeness Centrality及Degree Centrality值，选取前10位活性成分与靶点基因，结果见图3、表2，其中活性成分为MOL000098-槲皮素（quercetin；CAS号：117-39-5）、MOL000422-山奈酚（kaempferol；CAS号：520-18-3）、MOL000173-汉黄芩素（Wogonin；CAS号：632-85-9）、MOL000358 -β-谷甾醇（b e t a-s i t o s t e r o l；C A S 号：83-46-5）、MOL004624 -Longikaurin A（CAS号：75207-67-9）等，这些主要活性成分平均作用于20个靶标基因。图3中靶点基因包含有PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、SCN5A等，这些靶点基因平均影响29种活性化合物。

表2 “成分-靶点-靶点”网络关键节点拓扑学信息

图2 络风宁3号方“成分-靶点-疾病”网络图

图3 主要有效成分-核心靶点基因网络图

2.4 络风宁3号方治疗心律失常PPI网络的构建与分析通过STRING11.0数据库与Cytoscape3.7.2软件得到PPI网络图（图4），图中共有80个节点，1287条边，平均度值为47，Degree值≥47的靶点共19个，如IL-6、 VEGFA 、AKT1 、TNF、 MMP9等（表3）。

表3 络风宁3号方治疗心律失常的部分靶点

图4 络风宁3号方治疗心律失常PPI网络

2.5 络风宁3号方治疗心律失常富集分析通过DAVID数据库，对络风宁3号方治疗心律失常的交集靶点进行富集分析，输出富集条目一共489条，其中含有45种CC、424条BP、20类MF。通过R语言将按照富集基因数目排名前十条目进行可视化分析（图5）。MF方面主要涉及：蛋白结合（protein binding）、酶结合（enzyme binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、蛋白质激酶结合（protein kinase binding）等。BP主要涉及从炎症反应（inflammatory response）、信号转导（signal transduction）、抑制细胞凋亡（negative regulation of apoptotic process）、缺氧反应（response to hypoxia）、血管生成（angiogenesis）等。CC方面主要富集于质膜（plasma membrane）、细胞质（cytoplasm）、细胞膜（membrane）、线粒体（mitochondrion）等。KEGG富集分析得到共116条通路，主要包括有：PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway），根据通路包含基因数及校正后Pvalue值选取前20进行可视化分析（图6）。

图5 络风宁3号方主要活性成分的GO富集分析

图6 络风宁3号方治疗心律失常KEGG富集分析气泡图

3 讨论

现代医学视角下，炎症、氧化应激、离子通道异常等通常为心律失常发生的主要机制[7]。而在中医学理论体系中，心律失常发作则与内外风邪扰动心之络脉，继而络脉不宁、气血紊乱，这一病机密切相关[2]。从心律失常发生机制来看，炎症、氧化应激、离子通道的致病机制与中医体系中“风邪致病”有着内在联系。各种理化生物刺激均会引起心肌组织炎症反应，炎症因子被大量释放，通过促心肌纤维化损伤心肌结构[8]，或引起机体产热诱发心率增快，心肌缺血；或促进氧化应激引起钠离子（Na+），钙离子（Ca2+）等离子通路紊乱[9,10]导致心脏电传导异常，引起动风征象。络风宁3号方由王显教授基于络风内动理论并结合其临床经验创立，全方以徐长卿为君药，石菖蒲、柴胡、黄芩、半夏为臣，佐药选用麦冬、五味子、人参、三七，使药选用茯神、生龙齿，临床应用疗效显著。而本研究则通过网络药理学对络风宁3号治疗心律失常的作用机制进行进一步探讨。

研究发现，络风宁3号方治疗心律失常的主要活性成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、汉黄芩素、（E）-11-二十烯酸、5,7,8-三羟基黄酮等。这些活性成分可通过减轻炎症与氧化应激损伤，调节离子通道等多种方式来达到抗心律失常作用。槲皮素可通过降低低密度脂蛋白（LDL）氧化、减少粘附分子（CAMs）和其他炎症因子产生、保护内皮功能等途径改善心律失常[11]。山奈酚可以抑制血管细胞粘附分子1（VCAM-1）、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、内皮细胞选择素（E-selectin）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）及核转录因子κB（NFκB）和转录激活因子1（AP-1）通路，发挥抗心律失常的作用[12]。此外，山奈酚、槲皮素、β-谷甾醇等活性成分还对钠钾氯转运、Ca2+内流等离子通道具有调节作用[13,14]，其中，山奈酚可抑制L型钙通道Ca2+内流[14]；而槲皮素可以利用钠钾ATP酶（Na+/K+ATPase）产生的电化学势能，调节细胞质摄取氯离子（Cl-），从而刺激1型钠钾氯同工转运蛋白（NKCC1）的表达，达到改善心律失常的作用[15]。

此外，本研究共筛选出82个靶点因子，如IL6、VEGFA、AKT1、TNF、MMP9等，涉及炎症反应、氧化应激和调节离子通道等途径。作为促炎因子，TNF不仅可以降低心肌细胞的T型Ca2+电流密度，抑制离子通道，下调离子调通道蛋白表达[16]，也可通过激活蛋白激酶Cα（PKCα+），抑制超快速延迟整流钾通道（Ikur）导致心律失常[17]。此外，TNF可增加内皮细胞通透性和细胞间粘附分子1（ICAM-1）的表达，影响正常心肌细胞结构，诱发心律失常[18,19]。VEGF、MMP9等作为参与血管生成的重要因素，同样参与心律失常的病理过程[20,21]。其中VEGF除具有促进新生血管的作用外，还能直接调控心肌细胞收缩性[20]。Wolfgang Rottbauer等[22]研究发现VEGF可以通过激活心室心肌细胞中的磷脂酶C-γ1（PLCγ1），特别是血管内皮生长因子受体-1（FLT-1）受体来调节大鼠心室心肌细胞中的钙循环，导致心肌收缩异常。Mezach等[23]研究发现VEGF可破坏NaV1.5-rich ID纳米组织并减慢心房传导，诱发心律失常。

KEGG富集分析进一步获得络风宁三号方涉及到的116条通路，主要包括有：PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路等。ShiXin等[24]研究发现，与房颤预测相关的长链非编码RNA（lncRNA）主要富集于炎症通路中，且大多与TNF信号通路相关。TNF信号通路可使内皮细胞通透性的升高，加速Na+、Ca2+等离子内流，及炎症因子的释放，从而影响正常心肌细胞结构，改变电生理特点[18]。郑旭颖等[25]发现通过调控PI3K-Akt通路可以降低心律失常发作时间与发生率，原因在于PI3K-Akt通路启动下游靶蛋白哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），降低Beclin1，微管相关蛋白轻链3（LC3）的表达，防止心肌细胞过度自噬，保护心肌细胞从而减少心律失常发生[26]。此外，MAPK、Toll样受体、HIF1受体等信号通路还涉及对心脏电传导的调节[27-29]。连接蛋白43（Cx43）是心肌细胞中表达最丰富的连接蛋白，可在心肌细胞质膜上形成缝隙连接，用以调节细胞间的电生理和代谢耦合，因此对正常的心脏脉冲传导至关重要[30]。心肌损伤时升高的MMP9可水解N-钙粘蛋白（CDH2），降低心肌细胞Cx43，导致心室传导速度降低，激发波长降低发生心律失常[31]；而MAPK信号通路则可增加Cx43的磷酸化水平来降低心律失常的发生率[32]。Toll样受体信号同样参与调节心脏电冲动，其机制在于抑制内质网中Kv4.2/4.3，进而调节QT间期，维持心脏复极化[28]。

综上，络风宁3号方的主要成分有槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、汉黄芩素等。这些活性成分可能作用于IL6、VEGFA、AKT1、TNF、MMP9等靶标，调节PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、TLR信号通路、HIF-1等信号通路，从而发抗炎、抗氧化应激、调节离子通路等作用，降低心律失常的发生。本研究促进了络风宁3号方从经验医学到循证医学的转化，为进一步药物实验提供思路。但由于各个数据库计算方法不同，收集到的资料存在一定的偏倚，仅能尽可能接近真实全部的网络药理数据。此外药物之间相互作用情况尚未完全探明，需进一步深入的实验验证。