基于网络药理学研究银杏蜜环口服溶液对心脑血管保护的作用机制

薛岳进，李春晓，张璐莎，王倩怡，方乐玉，杨文杰，冷雨泽，孙伟，李梦瑶，陈璐，王虹

近年来，由于社会的快速发展和人类生活水平的提高，缺血性脑血管疾病（ICVD）、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病，CHD）和心绞痛（AP）的发病率呈上升趋势，对人类健康和生命造成极大的威胁。缺血性脑血管疾病病因复杂多样，是一种严重的神经系统疾病，由急性、持续性脑缺血或缺氧引起，主要与动脉狭窄、血液成分改变、血流动力学改变等有关，以动脉粥样硬化为病理基础[1-3]。冠心病是由心肌缺血、缺氧引起的临床综合征，又称为缺血性心脏病，即由冠状动脉（冠脉）粥样硬化使血管管腔狭窄、阻塞或体力过强、精神应激时引起[4]，临床症状包括心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病和猝死。心绞痛作为冠心病的一种常见类型，多由冠脉供血不足而引起心肌缺血缺氧[5]。脑心同治是基于中医药的辨证论治理论而提出的，根据同病异治或异病同治的方法来治疗心脑血管疾病。心脑血管疾病的共同病理基础是动脉粥样硬化，如何防治动脉粥样硬化成为脑心同治关键[6,7]。

银杏蜜环口服溶液有效成分为银杏叶提取物和蜜环粉，用于治疗冠心病、心绞痛、缺血性脑血管疾病，可改善心、脑缺血症状[8]。银杏叶提取物证实有明显的保护心脑血管缺血损伤、抗氧化、防治冠心病和防止动脉粥样硬化等作用[9-13]，蜜环菌也被证实具有心脑血管保护和改善冠状动脉的血液循环等作用[14-16]。临床上多用西药联合银杏蜜环口服溶液治疗心脑血管疾病，并且疗效明显，但是银杏蜜环口服溶液脑心同治的具体作用机制不够完善。

网络药理学是近年来提出的新理念，是融合了药理学、信息网络学和计算机科学的一门学科，通过数据挖掘、构建网络、网络分析等途径来预测药物的作用机制[17]。中医药理论具有整体观念的特点，而中药及复方制剂具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，网络药理学研究思路与中药研究思路吻合，对中药发展具有积极促进作用[18,19]。因此，本研究通过网络药理学来研究银杏蜜环口服溶液对脑心同治的作用机制。

1 材料与方法

1.1 有效成分的收集、筛选和作用靶点的预测通过TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[20]和文献挖掘银杏叶提取物、蜜环粉有效成分，并且根据OB≥30%、DL≥0.18进行筛选，蜜环粉中补充成分[8,14,16,21]通过Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找结构式，在SwissADME（http://www.swissadme.ch/）进行筛选[22]。然后，在Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测[23]，基于Homo sapiens按照可能性大于0.3进行筛选，银杏叶提取物成分的补充靶点[13,24,25]在CTD数据库（http://ctdbase.org/）进行挖掘[26]，将成分靶点在Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）中进行校正。

1.2 疾病靶点的获取疾病靶点在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中进行查找，输入Ischemic Cerebrovascular Disease、Coronary Atherosclerotic Heart Disease、Angina Pectoris获取疾病靶点，运用R软件将得到的成分靶点和疾病靶点分别取交集，得到三个疾病交集靶点再取交集即为脑心同治的作用靶点，将交集靶点在Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）中进行校正，并绘制Venn图。

1.3 成分-靶点-疾病网络的构建在Excel2019中，根据成分、成分靶点、脑心同治交集靶点构建“成分-靶点-疾病”数据库，用Cytoscape3.7.2[27]软件进行可视化、构建网络，并用CytoHubba根据度值来筛选核心成分。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络的构建在String数据库（https://string-db.org）中导入交集靶点数据，选择“homo sapiens”物种，按照默认设置，导出PPI网络互作图和tsv文件。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用R软件“clusterProfiler”软件包对脑心同治交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，设置P＜0.05，得到相应柱状图和气泡图。

2 银杏蜜环口服溶液的有效成分及作用靶点

通过TCMSP数据库和文献挖掘银杏叶提取物、蜜环粉有效成分，并且根据OB≥30%、DL≥0.18进行筛选，补充成分在SwissADME进行筛选。然后，在Swiss Target Prediction、CTD数据库进行靶点预测，将成分靶点在Uniprot数据库中进行校正。最后根据靶点情况，银杏提取物筛选出19个有效成分、蜜环粉5个成分，一共得到397个靶点，去重后得到183个靶点，表1。

表1 银杏蜜环口服溶液的有效成分及其靶点数量

2.1 疾病靶点疾病靶点在GeneCards数据库中进行查找，以“Ischemic Cerebrovascular Disease”、“Coronary Atherosclerotic Heart Disease”、“Angina Pectoris”为关键词检索，分别获得1074个、1865个、3707个疾病靶点。运用R软件将得到的成分靶点和疾病靶点分别取交集，分别得到集靶点91个、97个、134个，再将三种疾病靶点取交集，获得脑心同治71个靶点，在Uniprot数据库中进行校正，并绘制三种疾病靶点交集Venn图（图1）。

图1 药物成分靶点及脑心同治疾病靶点交集Venn图

2.2 银杏蜜环口服溶液成分-靶点-疾病网络的构建运用Cytoscape软件，将建立好的成分-靶点-疾病数据库导入，绘制网络图（图2）。共得到208个节点（其中24个成分，183个靶点，1个疾病名称）和468条边，图2中绿色三角代表银杏叶提取物成分，黄色三角代表蜜环粉成分，粉色椭圆形代表疾病，蓝色V型图形代表靶点，图中的连线代表各个节点之间的关系。其中Degree值排名前5的活性成分是quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）、luteolin（木犀草素）、Ginkgolide B（银杏内酯B）、Ginkgolide A（银杏内酯A）。Degree值排名前5的靶点是AKR1B1（醛酮还原酶1成员B）、XDH（黄嘌呤脱氢酶/氧化酶）、CYP19A1（细胞色素P450家族成员19A1）、CYP1B1（细胞色素P450家族成员1B1）、CA2（碳酸酐酶2）。

图2 银杏蜜环口服溶液成分-靶点-疾病网络图

2.3 PPI网络的构建和关键靶点的分析通过String网站，将脑心同治71个交集靶点导入，得到PPI网络互作图（图3）。在交集靶点PPI网络图中，共有71个节点，779条边，平均节点度为21.9。图中节点代表基因蛋白，连线代表蛋白之间的关系，线条的粗细代表蛋白互作关系的强弱。利用R软件计算各基因靶点Degree值，并且制作核心靶点柱状图（图4）。其中，排名前5的靶点是ALB（白蛋白）、IL-6（白细胞介素-6）、AKT1（蛋白激酶B1）、TNF（肿瘤坏死因子）、MAPK3（丝裂原活化蛋白激酶-3）。

图3 交集靶点蛋白-蛋白相互作用图

图4 交集靶点互作Barplot图

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用R软件“clusterProfiler”软件包对脑心同治交集靶点进行GO功能富集分析，设置P＜0.05，得到相应柱状图（图5）和气泡图（图6）。其中，柱状图X轴代表富集在GO上的基因数目，Y轴代表GO名称，柱形图代表富集在GO上的基因，P代表富集的显著性，颜色越红，富集程度越高，P值越小；气泡图中，X轴表示关联基因数与信号通路上总基因数的比值，气泡面积大小代表富集于GO的基因数量，气泡颜色代表P值，颜色越红，富集程度越高，P值越小，Y轴表示GO名称。银杏蜜环口服溶液脑心同治的核心靶点基因的GO功能主要和转录共激活因子结合（transcription coactivator binding）、血红素结合（heme binding）、四吡咯结合（tetrapyrrole binding）、磷酸酶结合（phosphatase binding）、核受体活性（nuclear receptor activity）、电子传递活性（electron transfer activity）、转录辅因子结合（transcription cofactor binding）、配体激活的转录因子活性（ligand-activated transcription factor activity）等有关。

图5 GO功能富集分析柱状图

图6 GO功能富集分析气泡图

利用R软件“clusterProfiler”软件包对脑心同治交集靶点进行KEGG通路富集分析，设置P＜0.05，得到相应气泡图（图7），靶点较多的通路有6条（表3）。气泡图中，X 轴表示关联基因数与信号通路上总基因数的比值，气泡面积大小代表富集于KEGG的基因数量，气泡颜色代表P值，颜色越红，富集程度越高，P值越小，Y轴表示KEGG名称。从KEGG通路富集分析图中可以明显看出，银杏蜜环口服溶液的脑心同治作用主要和焦点黏附（Focal adhesion）、内分泌抵抗（Endocrine resistance）、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抵抗（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、缺氧诱导因子-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、丝裂原活化激酶信号通路（MAPK signaling pathway）等信号通路有关，其中富集最显著通路的是PI3K-Akt signaling pathway。

表3 靶点较多的信号通路

图7 KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

银杏蜜环口服溶液主要由银杏叶提取物、蜜环粉组成。银杏叶最早在《神农本草经》中记载，归经入心、肺，具有敛肺平喘、通络止痛、活血化瘀和化浊降脂的功效，用于瘀血阻络、胸痹心痛，中风偏瘫、肺虚咳喘和高脂血症。蜜环菌是天麻的共生菌，最早在《皇和蕈谱》中记载，药理作用与天麻相似，归经入肝，具有平肝熄风止痉、定惊的功效，临床常用于治疗眩晕头痛、肢体麻木、惊风癫痫、腰膝酸软、破伤风等症状。近年来，心脑血管疾病的发病率不断升高，严重威胁人类的生命健康，银杏蜜环口服溶液可以有效改善心、脑缺血，因此，通过网络药理学来研究银杏蜜环口服溶液心脑血管保护的作用机制。基于以上研究结果发现，在确定的2味中药共24个有效成分的基础上，通过靶点预测，筛选出71个与脑心同治极为密切的潜在靶点。银杏蜜环口服溶液通过作用于ALB、IL-6、AKT1、TNF、MAPK3等多个靶点，从而调节相关信号通路，发挥心脑血管保护的作用。

通过分析银杏蜜环口服溶液的成分-靶点-疾病网络图，可以得知该制剂关键成分为quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）、luteolin（木犀草素）、Ginkgolide B（银杏内酯B）、Ginkgolide A（银杏内酯A）等。槲皮素可保护心血管、改善心功能，具有减轻心肌肥厚、防止血栓生成、扩张血管降血压、抗动脉粥样硬化、防治心肌缺血再灌注损伤等作用，槲皮素对缺血性脑血管疾病也有治疗效果，具有神经保护和抗氧化的作用，可以改善脑缺血后功能损伤[28-30]。槲皮素的抗动脉粥样硬化作用可能与下调HMGB1、TLR4表达有关，并且依赖药物剂量[31]；槲皮素可能通过抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表达来减轻脑组织损伤[32]。山奈酚具有抗氧化、对多种损伤组织保护、抗动脉粥样硬化等作用，可以有效治疗心脑血管疾病[33,34]。山奈酚可能通过抑制TLR4和NF-κB通路表达来减少IL-1β、TNF-α的产生，从而发挥脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[35]；山奈酚通过降脂、提高抗氧化力、抑制炎症来抗动脉粥样硬化，其改善炎症反应可能与抑制IL-1β、TNF-α的表达有关[36]。木犀草素对神经系统和心血管系统具有保护作用，可以抗动脉粥样硬化、抗心力衰竭、抗高血压、保护心肌缺血再灌注损伤、改善记忆力、提高认知功能等作用[37,38]。木犀草素发挥脑缺血保护作用，可能与增加Nrf2和Bcl-2的表达、抑制Bax的表达有关[39]；木犀草素通过抗脂质代谢紊乱和抗细胞凋亡分子机制来保护大鼠离体心肌缺血/再灌注损伤[40]。银杏内酯主要应用于心脑血管疾病，具有抗氧化、改善脑缺血、抗心律失常、抗动脉粥样硬化、保护中枢神经系统等作用[41-45]。银杏内酯可能通过调节TWEE-Fn14信号通路来保护心脏和大脑[46]；银杏内酯可能通过抑制炎症反应、抗氧化、抑制兴奋性氨基酸、改善能量代谢和抑制基因表达等多种途径预防和治疗ICVD[45]；银杏内酯B通过抗氧化和抗凋亡信号通路来发挥对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用，可能与抑制MAPK信号通路、提高Bcl-2表达、降低Bax表达有关[47]。因此，银杏蜜环口服液溶液中五个主要活性成分是脑心同治的重要成分，这说明银杏蜜环口服溶液通过多成分共同发挥作用。

根据成分筛选靶点和疾病靶点取交集，在String平台构建PPI网络互作图可以明显看出，ALB、IL-6、AKT1、TNF、MAPK3等是脑心同治重要靶点。研究表明，冠心病、心肌梗死、脑梗死等患者的ALB（血清白蛋白）水平明显低于正常人，这对临床治疗冠心病等心脑血管疾病有重要预测意义[48-50]。ALB还可以有效保护脑神经，不仅能改善血流还能保护脑细胞，从而促进神经再生[51]，缺血性卒中后大剂量ALB治疗可能具有神经保护作用[52]。AKT（蛋白激酶B）属于丝/苏氨酸蛋白激酶，主要活化途径是PI3K-AKT信号通路，PI3K可以激活AKT并且使其磷酸化，AKT1对心血管疾病具有重要意义[53,54]。AKT1具有调节炎症反应的功能，AKT1活化可能通过抑制JNK3信号通路参与抗缺血性脑损伤的神经保护作用[55]；有研究表明，儿茶素对冠心病大鼠FXR、STAT3和Akt的激活，可能对改善冠心病有重要意义[56]。IL-6、TNF是促炎细胞因子，促炎细胞因子不仅能够吸引巨噬细胞，还能激活NF-κB信号通路，刺激血管细胞产生炎性细胞因子[56]。在冠心病、心绞痛、脑缺血等心脑血管疾病中，IL-6、TNF-α在患者中呈高表达，因此降低患者IL-6、TNF-α水平对心脑血管疾病保护有重要意义[57-61]。有研究表明银杏黄酮通过阻断NF-κB信号通路和下调促炎性细胞因子，保护神经元免受I/R损伤[62]；瑞芬太尼预处理可以通过减少JNK信号通路和TNF-α/TNFR1信号通路的外源信号来保护脑缺血再灌注损伤，这可能为ICVD提供新的治疗途径[63]；儿茶素可通过抑制NF-κB信号通路、下调IL-6和TNF-α的表达等来改善大鼠冠心病[56]。MAPK3（丝裂原活化蛋白激酶-3）基因编码为ERK1，属于MAPK信号通路，可将细胞外刺激信号转导至细胞内，介导细胞生物化学反应和炎症反应[64,65]。有研究表明Ras/Raf/ERK1/2信号通路在神经细胞中起着促死亡凋亡的作用[66,67]；通过激活ERK1/2信号通路抑制细胞凋亡和过度自噬，可减轻心肌损伤[68]。因此，ALB、IL-6、AKT1、TNF、MAPK3等重要靶点可能通过细胞再生、细胞凋亡和炎症反应等途径来达到脑心同治的治疗作用。

将脑心同治71个交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，从P值和基因数目可以看出，GO功能分析主要涉及到转录共激活因子结合（transcription coactivator binding）、血红素结合（heme binding）、四吡咯结合（tetrapyrrole binding）、磷酸酶结合（phosphatase binding）、核受体活性（nuclear receptor activity）、电子传递活性（electron transfer activity）、转录辅因子结合（transcription cofactor binding）、配体激活的转录因子活性（ligand-activated transcription factor activity）等方面。KEGG通路富集分析图中可以看出，银杏蜜环口服溶液的脑心同治作用主要和焦点黏附（Focal adhesion）、内分泌抵抗（Endocrine resistance）、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抵抗（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、缺氧诱导因子-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、丝裂原活化激酶信号通路（MAPK signaling pathway）等信号通路有关。通过与PPI网络中关键靶点对比，这几条富集明显的通路均与IL-6、AKT1、TNF、MAPK3等靶点发挥协同作用。银杏蜜环口服溶液脑心同治需要多条信号通路发挥协同作用，其中最重要的信号通路是PI3K-Akt signaling pathway。PI3K-Akt信号通路是细胞内重要的信号转导通路，通过影响下游多个靶点来发挥抑制凋亡、促进增值的作用，对心脑血管疾病有重要意义。PI3K-Akt信号通路通过调节细胞凋亡、血管再生、代谢、炎症反应等进而影响其在心脑血管系统的表达，通过调控eNOS、GSK-3、NF-κB、Bcl-2、Caspase-3等发挥治疗心脑缺血疾病的作用[69,70]。木犀草素可能通过抑制MMP-9，激活PI3K-Akt信号通路而治疗缺血性脑卒中[71]，丹红注射液对大鼠缺血再灌注损伤的神经保护作用部分是通过激活PI3K-Akt信号通路来实现的[72]。淫羊藿苷具有抗I/R损伤的心肌保护作用，其抗氧化和抗凋亡作用部分与激活PI3K-Akt信号通路有关[73]；银杏内酯B可以降低心肌细胞的凋亡，其机制与增加PI3K-Akt信号通路上p-Akt的表达，上调Bcl-2的表达和下调Bax的表达有关[74]；槲皮素通过激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路，上调磷酸化PI3K及Akt表达，抑制NF-κB向核内转运，发挥其抗动脉粥样硬化的作用[75]。此外，银杏叶提取物不仅作用于PI3K-Akt信号通路来发挥神经保护作用，还作用于MAPK和LCN2-JAK2/STAT3这2条信号通路来改善缺血性脑卒中；山奈酚可能通过调节ASK1/MAPK信号通路和氧化应激来抑制心肌肥厚，表明MAPK信号通路是心脑缺血中的重要信号通路。因此，银杏蜜环口服溶液通过多途径、多靶点发挥脑心同治作用。

综上所述，银杏蜜环口服溶液治疗冠心病、心绞痛和缺血性脑血管疾病通过多成分、多靶点、多途径发挥作用，其主要活性成分是槲皮素、山奈酚、木犀草素、银杏内酯A、银杏内酯B等，关键靶点基因为ALB、IL-6、AKT1、TNF、MAPK3等，关键信号通路为Focal adhesion、Endocrine resistance、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、PI3K-Akt signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、MAPK signaling pathway等。本研究基于文献研究和数据库数据挖掘，成分和靶点的筛选带有一定的主观性，数据库存在许久未更新、收录不全等问题，有一定的局限性。未来应该通过实验和临床分析验证相关活性成分、靶点基因和关键信号通路，从而进一步阐述银杏蜜环口服溶液脑心同治的作用机制。