基于网络药理学和分子对接技术探讨熟地平颤方治疗帕金森病的分子机制

邱添，李泰平，肖红，刘卫国，康冰，杨宁

帕金森病(PD)是常见的老年人运动障碍，由大脑黑质致密部多巴胺能神经元变性引起[1]，主要特征有运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势平衡障碍[2-3]。目前治疗首选药为左旋多巴，但长期使用会导致疗效降低，不良反应增加。近年来，中医药疗法逐渐增加。PD在中医归属“颤证”范畴，病理性质总属于本虚标实，本虚为肝肾亏损，脏腑功能失调；标实为风火痰瘀毒互结，阻塞脑窍。基于该病机认识，总结出熟地平颤方，补肾平肝，取得了满意的疗效[4-5]。但该方治疗PD的主要活性成分及作用机制尚未阐明。网络药理学是一门最近兴起的交叉学科，它将药理学和生物信息学结合，通过“多成分、多靶点、多通路”全方位系统分析中药治疗相关疾病的作用机制。本研究运用网络药理学方法，结合分子对接技术系统分析并探讨熟地平颤方治疗PD的主要活性成分及其分子作用机制，为进一步研究提供理论基础。

1 方法

1.1 熟地平颤方活性成分的筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)(https://www.tcmsp-e.com/)，以口服生物利用度(OB)≥30%、药物相似度(DL)≥0.18、药物半衰期(HL)≥4 h[6]且血-脑屏障(BBB)≥-0.3[7]，筛选出熟地平颤方中的主要活性成分。应用TCM@TAIWAN台湾中医药资料库(http://tcm.cmu.edu.tw/index.php)查询其他中药活性成分，然后应用SwissADME平台(http://www.swissadme.ch/index.php)获得化合物ADME数据，设置参数肠胃道吸收(GI absorption)为“High”，BBB为“Yes”进行筛选[8]。

1.2 熟地平颤方活性成分的作用靶点预测 将该方活性成分通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获得化合物的2D化学结构SDF格式文件，然后输入Swiss Target Prediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch)，物种选择“人类(Homo sapiens)”，预测该方活性成分的潜在作用靶点(Probability>0)。

1.3 熟地平颤方治疗PD作用靶点的预测 应用GeneCards(https://www.genecards.org)和DisGeNET(https://www.disgenet.org/home)疾病靶点数据库以“Parkinson Disease”为关键词进行检索，将收集的疾病靶基因与活性成分作用靶点应用VENNY 2.1进行对比(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，获得中药活性成分和PD共同靶基因。

1.4 熟地平颤方治疗PD的靶蛋白相互作用PPI网络构建 应用STRING数据库(https://string-db.org，Version 11.0)输入收集的共同靶基因，设置物种为“人类(Homo sapiens)”，最低相互作用阈值为中度信度(Confidence 0.4)，其余参数保持默认，获取靶蛋白相互作用的数据，构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。通过Cytoscape 3.9.0软件构建熟地平颤方的中药-活性成分-靶点网络图。

1.5 基因本体论(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)通路富集分析 将上述有效成分与PD共同靶基因通过Metascape在线基因注释平台(https://metascape.org/gp/index.html)进行GO和KEGG富集分析。通过GO收集靶标基因或蛋白质的分子功能(MF)、细胞组分(CC)及其相关的生物学反应(BP)，进一步对相关基因功能进行描述。同时KEGG富集收集靶点所涉及的信号通路，以P<0.01为条件进行筛选，并结合DisGeNET富集分析，进一步研究熟地平颤方抗PD的主要作用机制，分析数据应用clusterProfiler软件以柱状图或气泡图可视化展示。

1.6 分子对接 利用分子对接技术揭示熟地平颤方治疗PD的主要有效成分及其相关作用靶基因。相关基因蛋白的晶体结构取自RCSB蛋白数据库(PDB，https://www.rcsb.org/)。应用PyMOL软件去除水和小分子配体的同时，加入氢并进行电荷平衡。应用Chem 3D软件将活性成分的SDF格式转换成MOL2格式。批量分子对接采用iGEMDOCK 2.1软件，默认参数，结果以EXCEL色阶图展示。采用结合能来评估成分与靶点的结合能力，结合能<0表明可以自由结合，结合能越低表明受体与配体之间的亲和力越大，二者发生相互作用的可能性就越高。

2 结 果

2.1 中药活性成分和作用靶点预测 以OB≥30%，DL≥0.18，HL≥4 h以及BBB≥-0.3为筛选条件筛选出熟地平颤方主要活性成分(表1)，以肠胃道吸收为“high”，BBB为“yes”条件筛选出天麻主要活性成分(表2)。共得到29个主要活性成分及504个预测作用靶点。其中作用靶点超过30个的活性成分包括天麻中的苏齐内酯(CID132350840)、4-(4′-羟苄氧基)苄基甲醚(CID5318157)和香茅醛(CID7794)，天南星中8,11,14-二十二碳三烯酸甲酯(CID536-4473)，枸杞子中的阿托品(CID637577)和亚油酸乙酯(CID5282184)，其交集的靶点数分别是44、40、34、42、35和34。

表1 熟地平颤方主要活性成分基本信息(TCMSP数据库)

表2 天麻主要活性成分信息(TCM@TAIWAN台湾中医药资料库)

2.2 治疗PD共同靶点的收集 见图1。使用Gene-Cards和DisGeNET疾病数据库分别检索到7 722个和2 078个PD相关基因靶点，将活性成分504个作用靶点与该疾病的靶点进行对比，获得178个共同靶点。

图1 熟地平颤主要中药活性成分作用靶点-PD靶点韦恩图

2.3 共同靶蛋白PPI网络的构建 通过STRING数据库分析178个映射获得PD的交集靶点，构建熟地平颤方抗PD的PPI网络图(图2)。中药成分和作用靶点数据导入Cytoscape 3.9.0软件构建熟地平颤方的中药-活性成分-靶点网络图(图3)。借助软件内置计算工具计算网络节点特征值参数，节点度值≥60获得熟地平颤方治疗PD最相关的11个基因，包括AKT1、ALB、MAPK3、CASP3、APP、EGFR、MAPK1、MAPK8、HSP90AA1、PTGS2和STAT3，见表3。

表3 熟地平颤方治疗PD主要作用的相关基因

2.4 GO功能富集分析 见图4。以P<0.01为筛选条件，活性成分筛选出参与药效的主要BP包括化学突触传递的调节、跨突触信号的调节、细胞钙离子稳态、神经元凋亡和丝氨酸肽基修饰等，主要CC包括神经元胞体、膜筏、膜微区、突触前和突触膜等，MF主要包括调控丝氨酸/苏氨酸及酪氨酸蛋白激酶活性、神经递质受体活性、肽链内切酶活性和铵离子结合等功能。

2.5 KEGG通路富集分析 KEGG富集分析显示，主要信号通路包括神经活动配体-受体相互作用、cAMP信号通路、雌激素信号通路和磷脂酶D信号通路等(图5)。此外，熟地平颤方在细胞凋亡、内分泌抵抗、自噬等方面发挥作用，还可治疗Alzheimer’s病(AD)、脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化、胰腺癌和前列腺癌等，但目前未见相关报道。DisGeNET功能富集显示熟地平颤方广泛参与认知障碍、淀粉样变性、记忆缺陷、神经痛和成瘾行为等方面的改善(图6)。

2.6 分子对接结果 通过STRING数据库和Cytos-cape软件获得潜在靶蛋白AKT1、ALB、MAPK3、CAS-P3、APP、EGFR、MAPK1、MAPK8、HSP90AA1、PTG-S2和STAT3，从RCSB蛋白数据库获取其晶体结构作为结合受体。以熟地平颤方中筛选出的29个活性成分为配体，以左旋多巴为对照，应用iGEMDOCK软件以默认参数进行批量对接。结果显示，CID 246983(Lan-osterol，羊毛甾醇)、CID 5997(Cholesterol，胆固醇)与PTGS2、CID 9548595(Sitosterol alpha1，α1-谷甾醇)与ALB结合能量值分别为-124.04 kcal/mol、-123.77 kcal/mol和-122.08 kcal/mol，均低于-120 kcal/mol且低于左旋多巴与相应蛋白的结合能值，见表4。

表4 潜在靶蛋白与熟地平颤方主要活性成分对接结果(kcal/mol)

3 讨 论

3.1 熟地平颤方有效成分和潜在靶点探讨

PD常见于中老年人，可导致生活质量下降以及照护负担增加[9]。长期临床实践发现，熟地平颤方主以滋补肝肾、通络解毒，可以改善PD的临床症状、延缓该病进展[10]。熟地平颤方由熟地黄、枸杞子、桑寄生、白芍、天麻、僵蚕、莪术、生天南星、全蝎、蜈蚣组成，以滋补肝肾、通络解毒立法，诸药合用，共奏滋肝补肾，搜风解毒，有通络散结之功[11]。本研究经过筛选共获得该方29种主要活性成分，504个潜在作用靶点，其中枸杞子的有效成分和作用靶点最多。作用靶点数量较多的活性成分有天麻中的苏齐内酯、4-(4′-羟苄氧基)苄基甲醚和香茅醛，天南星中的8,11,14-二十二碳三烯酸甲酯，枸杞子中的阿托品和亚油酸乙酯等，这些主要活性成分可能在治疗过程中发挥重要作用。熟地平颤方29种主要活性成分治疗PD最相关的11个基因中AKT1[12-13]、MAPK1[12，14]、STAT3[12，15]、MAPK8[16]、EGFR[17]、APP[18]、HSP90AA1[19]、PTGS2[20]和ALB[21]已被证实与PD密切相关。

分子对接结果显示，羊毛甾醇和胆固醇与PTGS2蛋白、α1-谷甾醇与ALB蛋白具有更紧密的亲和力。最新研究[22]也表明，PD发生与胆固醇存在密切关联。相关研究[23-24]发现，胆固醇可以通过p38依赖机制影响流体剪切力(FSS)介导的COX-2表达，COX-2受PTGS2基因调控，因此胆固醇可调控PTGS2影响PD病程。刘立娇等[25]研究发现，血清白蛋白与PD病情的严重程度相关，但α1-谷甾醇与白蛋白作用影响PD还未见相关研究。

3.2 熟地平颤方潜在作用机制探讨

3.2.1 神经活动配体-受体相互作用 PD基因组学研究[26-27]发现，神经活动配体-受体相互作用是影响PD最可能相关的通路之一。PD病理特征包括黑质多巴胺能神经元死亡和路易体神经元内聚集。α-突触核蛋白(α-syn)作为路易小体的主要组成部分，通过聚集成不溶丝状体参与PD的发病。研究[28]发现，α-syn可通过神经活动配体受体相互作用通路诱导微小RNA的失调产生神经毒性导致PD。α-syn与AD和PD密切相关[29-30]。AD主要是淀粉样蛋白-β(Aβ)通过突触蛋白的丢失来触发突触损伤；α-syn在PD神经元中聚集导致突触损伤[31]。因此，AD与PD具有共同的生理和病理联系，神经活动配体-受体相互作用是他们共有的通路之一[32]。KEGG通路富集分析显示，熟地平颤方也能发挥治疗AD作用，这与上述研究也相符合。

3.2.2 cAMP信号通路 在大脑中，cAMP与学习、记忆过程和其他大脑功能密切相关。作为第二信使，其主要的下游效应因子是蛋白激酶A(PKA)[33]。研究[34]发现，抑制微小RNA-200a可上调纹状体多巴胺受体D2的表达，通过cAMP/PKA通路抑制PD模型大鼠纹状体的凋亡。Zheng等[35]从白芍提取的芍药总糖苷(TG)可通过cAMP/PKA通路增加DA的生成治疗PD。此外，Ca2+和cAMP信号通路还控制着神经递质/激素的释放和神经元的死亡，其与糖尿病[36]和抑郁症[37]也密切相关。KEGG通路富集分析显示，熟地平颤方主要通过该信号通路发挥改善PD患者早期症状的作用。通过第二信使(如cAMP、Ca2+等)激活催化蛋白激酶从ATP转移出磷酸并共价结合到特定蛋白质分子中激活丝氨酸/苏氨酸及酪氨酸蛋白激酶，从而改变蛋白质、酶的构象和活性，在突触前和突触区域调控化学突触传递、跨突触信号和钙离子稳态等[38]，这与GO功能富集分析也相吻合。

传统观点认为，PD缺失多巴胺会阻碍运动，主要通过诱发基底核直接(dSPNs)或者非直接(iSPNs)通路中纹状体棘突投射神经元分别发生活动减退或者过度活动来完成。多巴胺D1受体可激活腺苷酸环化酶、促使形成cAMP，而D2受体则相反，对立的不平衡会导致运动机能异常。临床常用多巴胺前体左旋多巴(L-DOPA)治疗PD造成的这种运动障碍。研究[39]发现，L-DOPA或者D2受体激动剂逆转这些异常情况的效果比D1多巴胺受体激动剂的效果更好。但长期每日服用左旋多巴往往会导致左旋多巴诱导的运动障碍，其与纹状体的主要神经元中棘神经元中cAMP信号级联的失调密切相关[40]。刘玉涛等[5]发现，熟地平颤汤联合复方L-DOPA可显著提高临床疗效，有效改善PD症状的同时延缓了PD进程。动物实验[41]也表明，熟地平颤方可有效减轻黑质多巴胺能细胞损伤，改善PD大鼠震颤麻痹行为。

3.2.3 雌激素信号通路 女性PD发病率逐年增加，尤其是绝经期后，提示雌激素在PD发病中发挥重要的调节作用[42]。研究[43-44]发现，雌激素替代疗法可以明显改善PD和痴呆的症状。Qin等[45]研究发现，木犀草素-7-O-葡萄糖苷可通过雌激素受体介导的信号通路有效保护多巴胺能神经元免受1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)或1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的神经毒性作用。本研究中雌激素信号通路也是熟地平颤方干预PD的通路之一，但目前还未见相关研究。

3.2.4 磷脂酶D信号通路 磷脂酶D属于磷脂酶超家族，广泛分布于原核生物和真核生物中。它催化甘油磷脂底物的磷酸二酯键水解，生成磷脂酸和胆碱、乙醇胺、丝氨酸等亲水基团等产物。磷脂酶D可促进细胞增殖、发炎、病毒感染，并在神经退行性疾病、人类癌症和植物应激反应中发挥作用[46]。Conde等[47]研究发现，磷脂酶D激活与氧化诱导的突触损伤密切相关，在神经元退行性病变中起到非常重要的作用，下调磷脂酶D1可能为野生型α-syn触发的神经退行性病变初始阶段的早期机制。此外，磷脂酶D2活性的调节在PD的进展中也举足轻重，磷脂酸(磷脂酶D2的产物)作为多种细胞途径的第二信使可能是磷脂酶D2诱导神经退行性病变的关键[48]。本研究中熟地平颤方是否通过调节磷脂酶D的活性发挥抗PD的作用还需进一步研究证实。

3.2.5 其他 PD病理特征包括黑质多巴胺能神经元死亡和路易体神经元内聚集。α-syn通过聚集成不溶丝状体导致突触损伤，进而导致PD[49]。相关研究[11]证明，熟地平颤方可通过抑制α-syn过表达，减少黑质多巴胺能细胞的损伤，可有效缓解PD症状。DisGeNET富集分析揭示，熟地平颤方广泛参与了认知障碍、淀粉样变性、记忆缺陷等方面的改善，因此熟地平颤方可全方位改善PD临床相关症状。此外分析结果提示，熟地平颤方还可用于治疗脂质和动脉粥样硬化、胰腺癌和前列腺癌等，但目前还未见相关报道。

3.3 总结

综上所述，本文通过网络药理学结合分子对接技术研究发现熟地平颤方可能通过羊毛甾醇、胆固醇、α1-谷甾醇等关键成分作用于PTGS2、ALB、AKT1等靶点，主要通过神经活动配体-受体相互作用、cAMP、雌激素、磷脂酶D等信号通路发挥治疗PD的作用，初步揭示该方通过多成分、多靶点及多通路影响PD进程，为其进一步研究提供了新的方向。