髓系细胞触发受体2在缺氧缺血性脑室周围白质软化新生大鼠中的表达及对少突胶质细胞髓鞘化的影响

田金富，付惠玲，李芳，元芳芳，陈惠军，赵卫东，宋舜意，石彩晓

在胎龄小于30周的早产新生儿中，约5%～10%发生脑损伤。其中儿童脑室周围白质软化(PVL)是造成早产儿脑瘫的主要原因，常伴有智力低下、眼部异常、抽搐等症状[1]。PVL发病机制复杂，与缺血、缺氧、炎症反应等多种因素相关[2-3]，以少突胶质细胞减少、少突胶质细胞成熟障碍及髓鞘形成障碍为特点[4]。少突胶质细胞占胶质细胞总数的5%～10%，是CNS的髓鞘细胞，主要负责髓鞘的产生[5]。髓鞘的正常生成与轴突结构完整及信号快速传递密切相关，而髓鞘碱性蛋白(MBP)作为髓鞘的特异性标志物，可反映髓鞘结构损伤程度[6]。叶孝严等[7]研究表明，缺血缺氧处理可导致新生大鼠脑室周围白质病变、少突胶质细胞减少等，严重影响新生大鼠的空间学习记忆能力，因此探究与少突胶质细胞髓鞘化有关的因子是近年来的研究热点。髓系细胞触发受体2(TREM2)主要表达于小胶质细胞、巨噬细胞等，与炎症反应、神经系统疾病、脑室周围白质软化及灰质损伤密切相关[8-9]，但关于TREM2与少突胶质细胞髓鞘化的相关性研究较少，因此本研究通过建立缺血缺氧性PVL新生大鼠模型，探究TREM2在PVL新生大鼠中的表达及其对少突胶质细胞髓鞘化的影响，为研究PVL发病机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取28只健康SPF级SD新生大鼠(广东省医学实验动物中心)，日龄2～4 d，质量6～10 g。按照随机数字法将大鼠分为模型组和假手术组，每组14只，雌雄不限。

1.2 主要试剂及仪器 HE染色试剂盒(上海生工公司，货号：E607218-0200)；蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(上海碧云天公司，货号：P0027、P0011)；TNF-α、IL-1β、ELISA试剂盒、RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：SEKM-0034、SEKM-0002、R2220)；TREM2、MBP、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)兔抗鼠一抗、羊抗兔IgG(美国Abcam公司，货号：ab209814、ab209328、ab8245、ab150077)。PUZS-300全自动生化分析仪(上海帝博思生物科技有限公司)；RM2125RTS手动轮转式切片机(德国Leica公司)；SMZ745光学显微镜(日本尼康)；Simpliamp PCR仪(美国ABI)；1659001蛋白电泳仪、Trans-Blot SD半干转膜仪(美国Bio-Rad公司)；GIS-500凝胶成像仪(Miulab公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备 按参考文献[10]制备缺氧缺血性PVL新生大鼠模型。将模型组新生大鼠麻醉后呈仰卧位固定在显微镜下，用碘伏对大鼠体表消毒，在颈部靠近器官右侧做0.5～1 cm的纵向切口，分离颈总动脉并用缝合线行双结扎，在结扎的中间位置剪断动脉并缝合切口，手术时间不超过10 min，手术温度保持在35～37 ℃。术后将大鼠放入缺氧箱2.5 h，温度37 ℃，湿度65%，氧气8%，氮气92%，缺氧处理结束后放回母鼠身边继续喂养。对照组仅进行颈动脉分离，不进行结扎及缺氧处理。

1.3.2 标本采集 两组大鼠分别在造模后3 d、7 d处死，每个时间点处死7只。经麻醉处死后迅速取得大鼠脑组织(视交叉中心前后2 mm)，2只用于HE染色，2只用于透射电镜观察，3只用于炎症因子检测和TREM2、MBP的蛋白及mRNA表达检测。

1.3.3 HE染色观察新生大鼠脑组织形态 造模后3 d、7 d各取2只大鼠脑组织行HE染色。脑组织经4%的多聚甲醛溶液固定，低浓度至高浓度乙醇脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋后进行切片，再经二甲苯脱蜡及高浓度至低浓度梯度酒精处理后，使用HE试剂盒进行染色。于光镜下观察脑室周围白质区病理学变化并拍照。

1.3.4 透射电镜观察新生大鼠脑组织少突胶质细胞间超微结构 造模后3 d、7 d各取2只大鼠脑部胼胝体组织行透射电镜观察。将待测组织置于2.5%戊二醛中保存，在1%锇酸中固定24 h，经丙酮脱水、环氧树脂包埋后切片，经醋酸双氧铀、硝酸铅染色后于电镜下观察并拍照。5 000倍下观察髓鞘化轴突数目及形态，8 000倍下观察少突胶质细胞形态。

1.3.5 大鼠脑组织炎症因子表达检测 造模后3 d、7 d各取3只大鼠左侧脑组织行ELISA检测。将待测脑组织加入磷酸盐缓冲溶液，低温下充分研磨，离心后取上清液，根据TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒中的要求测定大鼠脑组织中炎症因子的表达。

1.3.6 大鼠脑组织TREM2、MBP蛋白表达检测 造模后3 d、7 d各取1.3.5中大鼠右侧脑组织行Western blotting检测。根据蛋白提取试剂盒的要求提取脑组织中的蛋白质，根据BCA试剂盒的要求测定脑组织中蛋白质浓度，将待测样品加热变性，各取20 μl待测样品液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，采用湿转法将全部蛋白转膜，吐温-20-三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液(TBST)洗涤，置于脱脂奶粉溶液(5%)中并在摇床上室温封闭2 h，加入1∶1 000的TREM2、MBP、GAPDH兔抗鼠一抗，4 ℃冰箱中过夜，经TBST漂洗3次后加入1∶2 000的羊抗兔二抗溶液并室温孵育2 h，TBST再次洗涤3次，行增强化学发光法进行显色。在凝胶成像仪中观察条带并拍照，以Image-J软件分析各组脑组织中TREM2、MBP蛋白相对表达。

1.3.7 实时PCR测定大鼠脑组织TREM2、MBP mR-NA表达 取1.3.6中大鼠脑组织测定TREM2、MBP mRNA表达。根据RNA提取试剂盒要求提取各组大鼠脑组织的总RNA，利用逆转录试剂盒反转录获取cDNA。TREM2引物序列：上游引物5′-GGA TGC TGG AGA TCT CTG GTT-3′，下游引物5′-ATG AAG GCC AGG AGG AGA A-3′；MBP引物序列：上游引物5′-AAT CGG CTC ACA AGG GAT TCA-3′，下游引物5′-TCC TCC CAG CTT AAA GAT TTT GG-3′；内参β-actin引物序列：上游引物5′-CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAA CA-3′，下游引物5′-GCT AGG AGC CAG GGC AGT AAT C-3′。反应体系：上游引物、下游引物各0.5 μl，H2O 8 μl，2×SYBR Mix10 μl，DNA模板1 μl；反应条件：95 ℃预变性、变性、60 ℃退火延伸、72 ℃延伸，共40个循环。根据2-△△CT算法进行计算。

2 结 果

2.1 模型组与假手术组大鼠一般情况 造模过程中各组大鼠均未出现死亡。假手术组状态良好，生长迅速，发育正常，肤色红润。模型组皮肤苍白、发绀，周身发育不良，表现为烦躁不安、四肢抽搐、大小便失禁、嗜睡、活动减少、睁眼迟缓、运动障碍、生长发育迟缓等。

2.2 模型组与假手术组大鼠脑组织形态的比较 见图1。假手术组大鼠脑组织形态结构基本正常，细胞染色清晰、核呈圆形、细胞结构完整、分布均匀、排列整齐紧密；随着时间的延长，细胞形态更加清晰且逐渐成熟变大。模型组造模后3 d、7 d大鼠脑室周围白质细胞数目显著减少，细胞间隙变大，细胞形态发生明显变形，出现细胞核固缩、白质纤维结构紊乱、疏松、坏死、出现缺失等现象，呈现条索状、囊性坏死及软灶化。

图1 各组大鼠脑组织形态(HE，×200) A：假手术组3 d；B：假手术组7 d；C：模型组3 d；D：模型组7 d

2.3 模型组与假手术组大鼠少突胶质细胞超微结构观察 见图2、图3。假手术组少突胶质细胞形态结构完整，细胞核膜及细胞膜较明显，细胞核清晰，细胞染色均匀、分布均匀，且少突胶质细胞间有致密的缝隙连接；模型组少突胶质细胞形态不完整，结构异常，细胞核不明显且染色不均匀，细胞之间的缝隙连接出现断裂、不连续等现象。假手术组髓鞘轴突染色深且数目较多，髓鞘较厚、排列均匀且紧密；与假手术组相比，模型组髓鞘轴突数目显著减少，髓鞘变薄、分布稀疏。

图2 各组大鼠少突胶质细胞超微结构观察(×8 000) A：假手术组3 d；B：假手术组7 d；C：模型组3 d；D：模型组7 d

图3 两组大鼠髓鞘化轴突数目比较(×5 000) A：假手术组3 d；B：假手术组7 d；C：模型组3 d；D：模型组7 d

2.4 模型组与假手术组大鼠脑组织中炎症因子表达的比较 见表1。与造模3 d相比，造模7 d后模型组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β表达水平显著升高(F=3.849，P=0.018；F=3.416，P=0.027)。与假手术组相比，模型组大鼠各时间点脑组织TNF-α、IL-1β表达水平均显著升高(均P<0.05)。

表1 模型组与假手术组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β表达的比较(±s，n=3)

表1 模型组与假手术组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β表达的比较(±s，n=3)

组别TNF-α(pg/ml)3 d7 dIL-1β(pg/ml)3 d7 d假手术组123.50±6.58126.06±6.5051.12±5.5252.30±5.31模型组159.26±9.54190.31±10.21∗94.13±8.68120.16±9.94∗F值5.1969.1627.24210.430P值0.0070.0010.0020.000

2.5 模型组与假手术组大鼠脑组织TREM2、MBP mRNA表达的比较 见表2。假手术组各时间点大鼠脑组织TREM2、MBP mRNA表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)；模型组大鼠脑组织TREM2、MBP mRNA表达水平均随时间延长而上升，差异具有统计学意义(F=5.751，P=0.005；F=9.699，P=0.001)。与假手术组相比，模型组各时间点大鼠脑组织TREM2、MBP mRNA表达水平均显著降低(均P<0.05)。

表2 模型组与假手术组大鼠脑组织中TREM2、MBP mRNA表达情况(±s，n=3)

表2 模型组与假手术组大鼠脑组织中TREM2、MBP mRNA表达情况(±s，n=3)

分组TREM2/β-actin3 d7 dMBP/β-actin3 d7 d假手术组0.74±0.130.98±0.150.85±0.141.01±0.16模型组0.30±0.020.51±0.060.24±0.030.52±0.04F值5.7945.0397.3795.146P值0.0040.0070.0020.007

2.6 模型组与假手术组大鼠脑组织TREM2、MBP蛋白表达的比较 见表3、图4。假手术组大鼠各时间点脑组织TREM2、MBP蛋白表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)；模型组大鼠脑组织TREM2、MBP蛋白表达水平均随时间的延长而上升，差异具有统计学意义(F=4.748，P=0.009；F=4.648，P=0.010)。与假手术组相比，模型组各时间点大鼠脑组织TREM2、MBP蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05)。

表3 模型组与假手术组大鼠脑组织中TREM2、MBP蛋白表达情况(±s，n=3)

表3 模型组与假手术组大鼠脑组织中TREM2、MBP蛋白表达情况(±s，n=3)

分组TREM2/GAPDH3 d7 dMBP/GAPDH3 d7 d假手术组0.82±0.141.01±0.150.83±0.131.03±0.16模型组0.26±0.040.53±0.090.23±0.040.47±0.08F值6.6624.7537.6415.422P值0.0030.0090.0020.006

图4 各组大鼠脑组织中TREM2、MBP蛋白表达情况 A：假手术组3 d；B：假手术组7 d；C：模型组3 d；D：模型组7 d

3 讨 论

PVL是早产新生儿常见的脑损伤疾病，常伴有视听障碍、智力低下、脑瘫等不良症状。对于PVL，目前没有统一且有效的治疗方案，因此探究PVL发病机制是近年来的研究重点。多项研究[11-12]认为，缺氧、缺血及炎症反应均是PVL发病的重要因素。资料[13-14]显示，早产的PVL患儿常有少突胶质前体细胞丢失、少突胶质细胞成熟失败、神经元树突结构异常及髓鞘形成障碍等表现。Cheng等[15]通过缺血缺氧法建立PVL新生大鼠模型发现，大鼠少突胶质细胞核膜受损，呈现萎缩、变形及坏死状态，髓鞘细胞生长受阻且存在大量小空泡。本研究通过结扎颈动脉、缺氧箱放置制造缺血、缺氧环境来构建PVL新生大鼠模型。结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠生长发育迟缓，有运动减少、四肢抽搐等表现，表明缺血、缺氧对大鼠脑组织造成了损伤。脑组织HE染色及透射电镜观察结果显示，模型组大鼠脑组织形态异常，脑室周围白质细胞、少突胶质细胞数目、髓鞘形成显著减少，细胞间的缝隙连接不紧密，形态发生明显变形，白质纤维结构出现坏死、缺失等，进一步表明PVL模型构建成功。

资料[16]显示，PVL与宫内感染及炎症反应密切相关，通过对大鼠腹腔注射脂多糖溶液诱导炎症性PVL新生大鼠模型发现，大鼠脑组织TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子表达水平显著升高，MBP表达水平显著下降。MBP是髓鞘的特异性标志物，可反映髓鞘结构的损伤程度；MBP表达水平越低，表明髓鞘受损越严重[17]。李健等[18]采用颈动脉结扎及缺氧处理建立缺血缺氧性PVL新生大鼠模型发现，模型组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β均显著升高。本研究结果显示，模型组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β表达水平随建模时间的延长呈现上升趋势，各时间点模型组大鼠脑组织中炎症因子表达水平均显著高于假手术组，MBP蛋白及mRNA表达水平均显著低于假手术组，与李健等[18]研究结果类似。这表明缺血、缺氧PVL与炎症反应相互关联，缺血、缺氧可导致促炎因子的增加，可能与少突胶质细胞减少及髓鞘化障碍有关。

TREM2是TREMs家族成员，主要表达于少突胶质前体细胞、小胶质细胞等多种神经细胞，与神经炎症反应密切相关。研究[19]发现，TREM2过表达可缓解认知缺陷，减少β-淀粉样蛋白斑块的沉积，减少突触和神经元的丢失，改善神经炎症。Jadhav等[20]研究发现，TREM2缺失会诱发小鼠海马突触可塑性受损、小胶质细胞形态改变、少突胶质细胞及髓鞘特异性转录产物减少，严重影响神经功能。王大雨等[21]研究发现，TREM2在大鼠PVL模型中显著降低，认为TREM2表达失调会导致炎症因子表达增加及机体抗炎症系统失调。本研究结果显示，各时间点模型组大鼠脑组织TREM2蛋白及mRNA表达水平均显著低于假手术组，表明PVL大鼠脑组织中TREM2表达失衡，加上新生大鼠的神经系统发育不完全，对缺血、缺氧引发的炎症反应等极其敏感，导致TNF-α等炎症因子表达增加，进而加剧脑组织、少突胶质细胞及髓鞘结构的损害。

综上所述，TREM2在缺血缺氧性PVL新生大鼠脑组织中呈现低表达，可能与PVL大鼠少突胶质细胞髓鞘化障碍存在一定关联。由于PVL大鼠发病机制复杂，本研究只是处于初步探讨阶段，TREM2下游相关通路与PVL的关系仍需深入研究。