远端缺血后处理对新生缺氧缺血性脑病小鼠组织型纤溶酶原激活物/脑源性神经营养因子通路及海马突触可塑性的影响

徐霞，徐琳琳，王艺

新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是围产期窒息缺氧导致的脑供血不足或中止等导致的脑损伤综合征[1-2]。HIE发病机制复杂，病死率和致残、致瘫率较高[3]，且目前尚无有效治疗方法，受到较多关注[4]。研究发现，缺血、缺氧引起的神经元凋亡坏死及代谢障碍是导致HIE幸存患儿神经瘫痪及致残的主要病理机制[5]，而寻找促进神经细胞及组织再生、修复的方法以改善HIE神经功能缺陷一直是广大学者探究和奋斗的目标[6]。研究[7]证实，组织型纤溶酶原激活物(tPA)可通过调控神经树突分泌脑源性神经营养因子(BDNF)相关转导通路，调节细胞发育、存活、生长，进而保护神经树突结构和功能、促进突触重塑和新生等过程，提示tPA/BDNF通路可能在HIE神经功能损伤后突触重塑及再生中发挥重要作用。一个器官的短暂缺血可诱导另一器官的缺血耐受，即远端缺血后处理(RIPoC)，可减缓脑缺血缺氧损伤并发挥脑神经保护作用[7]，是治疗HIE的新思路之一，但具体分子生物学机制并不明确。本研究通过建立新生小鼠HIE模型进行探讨，以期阐明RIPoC发挥脑保护作用的可能机制，为临床HIE治疗提供参考。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级新生C57BL/6j小鼠60只，质量(10±1)g，7日龄，由广东省医学实验动物中心提供[生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002，动物质量合格证号：省科委2018A027]。小鼠均于本院动物房中饲养，自然光照，自由饮食、饮水，温度25 ℃，相对湿度50%，噪音低于80分贝，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气。本研究经本院动物伦理委员会批准同意[批号：IACUC-01(20160917)]，符合3R原则。

1.1.2 主要试剂及仪器 海马组织突触相关蛋白突触后致密物-95(PSD95)、突触囊泡膜蛋白(SYP)、钙离子结合蛋白鉴定蛋白复合体S100A10(p11)、tPA、BDNF、酪氨酸蛋白激酶B(TrKB)等抗体(货号：ab238135、ab184176、ab76472、ab157469、ab108319、ab187041，美国abcam公司)，BDNF前体蛋白(Pro-BDNF)抗体(货号：CYT-014，以色列ProSpec-Tany公司)；HE染色试剂盒(货号：LMO105，上海联迈生物工程有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(T8170，北京索莱宝科技有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒和胰蛋白酶(货号：P0768、P0231，美国Pierce公司)；蛋白电泳仪、半干转膜仪(型号：1659001、Trans-Blot SD，美国Bio-Rad公司)等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠HIE模型建立及分组给药方法 将60只小鼠用随机数字表法分为假手术组、模型组、RIPoC组，每组20只。除假手术组外，其余各组小鼠参照文献[8]建立HIE模型。具体操作方法：将小鼠用戊巴比妥钠麻醉后，仰卧位固定于手术台上，用酒精对颈部皮肤进行消毒，在体视解剖显微镜下于颈部正中切口，钝性分离肌肉组织，暴露右侧颈总动脉并双重结扎，之后缝合手术切口，涂抹红霉素软膏。送回母鼠笼内室温恢复2 h，转入低氧箱(持续通入体积分数为8% O2+体积分数为92% N2混合气体的密闭箱)中37 ℃模拟缺氧过程1.5 h。HIE造模完成后，RIPoC组参照文献[9]于双侧后肢股三角处游离股动脉，用4-0丝线打活结阻断股动脉5 min后，松开丝线再灌流5 min，反复循环3次以实现远端肢体缺血后处理，之后小心放回母鼠笼中喂养。假手术组仅暴露右侧颈总动脉不进行结扎，其余操作同模型组。

1.2.2 各组小鼠脑组织TTC染色及脑梗死体积的检测 各组小鼠均于HIE造模后24 h随机取6只，麻醉后断头处死，取大脑组织，在-20 ℃冰箱快速冷冻20 min，制作30 μm厚的大脑皮质冠状面切片，置于2% TTC溶液中染色40 min(37 ℃，避光)。用图像采集系统拍照，Image ProPlus 6.0软件测量各组小鼠脑片的损伤面积。脑梗死体积=脑损伤面积(染色为白色)×切片厚度(30 μm)。

1.2.3 各组小鼠海马组织突触体数量的检测 各组小鼠均于HIE造模后24 h随机取6只，参照文献[10]采用透射电镜观察各组小鼠海马组织突触体。麻醉小鼠，用生理盐水行左心室-主动脉灌注固定后于冰上迅速取海马组织，制成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，放入2.5%戊二醛中固定4 h后，用1%锇酸缓冲液固定2 h，不同浓度丙酮依次脱水、浸蜡、包埋后，切成超薄切片，用醋酸铀、柠檬酸铅双染色后于透射电镜下观察神经细胞超微结构。随机取5个视野计算突触体数量，并进行摄片。

1.2.4 各组小鼠海马组织病理变化的观察 HIE造模后24 h将各组余下8只小鼠麻醉后断头处死取海马组织，剪取0.5 g置于-80 ℃冰箱保存。剩余海马组织迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h后，常规透明、浸蜡、包埋后，切成厚度为5 μm的切片，按HE染色试剂盒说明书进行染色、脱水、透明、封片后，置于光学显微镜下观察组织病理变化。

1.2.5 各组小鼠海马组织PSD95、SYP、p11、tPA、BDNF、Pro-BDNF、TrKB蛋白相对表达水平的检测 采用Western Blotting法检测海马组织中PSD95、SYP、p11、tPA、BDNF、Pro-BDNF、TrKB蛋白相对表达水平。取1.2.4中-80 ℃冰箱保存的海马组织，蛋白提取试剂盒提取蛋白并经BCA试剂盒测定蛋白浓度。取50 μg蛋白进行电泳、转膜、5%的脱脂奶粉溶液封闭2 h后，加入一抗抗体(PSD95、SYP、p11、tPA、BDNF、Pro-BDNF、TrKB抗体稀释浓度为1∶1 000，内参β-actin抗体浓度为1∶2 000)于4 ℃冰箱中孵育过夜，经TBST漂洗3次，加入1∶1 000的羊抗兔二抗溶液，于摇床上室温孵育2 h，经TBST再次漂洗3次。采用增强化学发光法显色后拍照，并以Image-J软件分析各组蛋白相对表达。

2 结 果

2.1 各组小鼠脑梗死体积的比较 与假手术组[(0.00±0.00)mm3]相比，模型组[(29.69±3.12)mm3]及RIPoC组[(18.28±2.11)mm3]小鼠脑梗死体积显著升高(均P<0.05)。与模型组相比，RIPoC组小鼠脑梗死体积显著降低(P<0.05)。

2.2 各组小鼠海马组织突触体数量检测结果 见图1。假手术组小鼠海马组织突触体数量较多，突触间隙清晰可见；模型组小鼠海马组织突触体数量减少，突触间隙不清；RIPoC组小鼠突触体数量较模型组较多。

图1 各组小鼠海马组织突触体电镜观察(×15 000) A：假手术组；B：模型组；C：RIPoC组

2.3 各组小鼠海马组织结构的比较 见图2。HE染色下，假手术组小鼠海马组织结构正常。模型组小鼠海马区组织神经元肿胀、胞体固缩、模糊、丢失坏死严重且部分神经元染色较深。RIPoC组小鼠海马组织神经元胞体固缩、丢失坏死现象均有所改善，且神经元形态和染色趋于正常。

图2 各组小鼠海马组织HE染色(×400) A：假手术组；B：模型组；C：RIPoC组

2.4 各组小鼠海马组织突触相关蛋白PSD95、SYP表达水平的比较 见表1、图3。与假手术组相比，模型组与RIPoC组小鼠海马组织突触相关蛋白PSD95、SYP表达均显著降低(均P<0.05)。与模型组相比，RIPoC组小鼠海马组织突触相关蛋白PSD95、SYP表达均显著升高(均P<0.05)。

图3 海马组织突触相关蛋白PSD95、SYP蛋白表达免疫印迹图

表1 各组小鼠海马组织突触相关蛋白PSD95、SYP蛋白表达水平的比较(±s，n=8)

表1 各组小鼠海马组织突触相关蛋白PSD95、SYP蛋白表达水平的比较(±s，n=8)

组别PSD95/β-actinSYP/β-actin假手术组1.03±0.151.01±0.12模型组0.44±0.10∗0.49±0.13∗RIPoC组0.73±0.12∗△0.76±0.15∗△ 注:与假手术组相比∗P<0.05;与模型组相比△P<0.05

2.5 各组小鼠海马组织p11、tPA、BDNF、Pro-BDNF、TrKB蛋白表达水平的比较 见表2、图4。与假手术组相比，模型组与RIPoC组小鼠海马组织p11、tPA、BDNF、TrKB表达显著降低(均P<0.05)，Pro-BDNF蛋白表达升高(均P<0.05)。与模型组相比，RIPoC组小鼠海马组织突触相关蛋白p11、tPA、BDNF、TrKB表达显著升高(均P<0.05)，Pro-BDNF蛋白表达显著降低(P<0.05)。

表2 各组小鼠海马组织p11、tPA、BDNF、Pro-BDNF、TrKB蛋白表达水平的比较(±s，n=8)

表2 各组小鼠海马组织p11、tPA、BDNF、Pro-BDNF、TrKB蛋白表达水平的比较(±s，n=8)

组别p11/β-actintPA/β-actinBDNF/β-actinPro-BDNF/β-actinTrKB/β-actin假手术组1.89±0.131.58±0.141.76±0.130.18±0.112.03±0.14模型组0.24±0.10∗0.29±0.13∗0.34±0.10∗1.49±0.13∗0.21±0.13∗RIPoC组0.69±0.12∗△0.66±0.14∗△0.91±0.13∗△0.58±0.12∗△0.85±0.13∗△ 注:与假手术组相比∗P<0.05;与模型组相比△P<0.05

图4 海马组织p11、tPA、BDNF、Pro-BDNF、TrKB蛋白表达免疫印迹图

3 讨 论

HIE是新生儿期常见的疾病之一，近年来随着围生期医学诊疗技术水平的提高，HIE患儿存活率虽逐渐升高，但易发生脑瘫、癫痫、全身神经系统瘫痪等神经系统后遗症，给家庭和社会带来沉重负担[11]。新生鼠脑部的血液供应与人类相似，且鼠出生后7 d脑部成熟度与足月新生儿相近，结扎一侧颈总动脉后低氧处理可使脑血流量降低从而成功模拟HIE模型[12]。研究[13]证实，在缺氧、缺血发生的数小时内，对缺氧、缺血敏感的神经干或神经前体细胞即可发生坏死和凋亡，且神经元凋亡是脑损伤后神经元迟发性死亡的关键触发因素。本研究建立小鼠HIE模型发现，模型组小鼠脑梗死体积为(29.69±3.12)mm3，且海马区神经元细胞胞体固缩、丢失、坏死严重，提示造模成功。

突触丢失是造成神经功能系统缺损的重要生物学因素，突触体数量可反映突触连接情况，是突触可塑性的评价指标[14]。林凌等[15]发现，HIE导致的神经树突棘及突触减少可能是HIE神经系统功能缺失的原因。本研究模型组小鼠海马组织中突触体数目明显减少，表明HIE可导致海马组织中突触体减少、突触可塑性降低。近来研究[16]发现，RIPoC可缓解脑损伤，且操作简单、方便，有较高临床应用价值，为治疗脑缺血损伤提供了新的思路和方法。靳奥洁等[17]发现，RIPoC可明显降低脑梗死患者的神经功能缺损评分、生活能力丧失评分及血清炎症因子水平，保护患者神经功能。本研究发现，RIPoC组小鼠海马区神经元损伤明显减轻，脑梗死体积降低至(18.28±2.11)mm3，突触体数量较模型组有所增加，提示RIPoC可改善HIE小鼠突触可塑性，缓解神经元坏死等脑损伤。然而其分子生物学机制还不甚明确，本研究将进一步对此进行探究。

PSD95是位于突触后膜的的重要突触信号组件，可调节突触活性和细胞内信号转导，并维持突触后膜结构稳定，在突触可塑性中发挥重要作用[18]。SYP位于神经元突触前膜上，其磷酸化水平增加可调节突触囊泡向突触前膜移动，将神经元电化学信号转化为化学信号。已有研究[19]证实，SYP与神经生长、修复、再生及突触可塑性关系密切。向杜炼等[20]发现，电针治疗可通过调节突触相关蛋白PSD95表达，促进海马区突触可塑性，改善神经突触丢失进而发挥治疗作用；赵刚等[21]发现，小强度跑台运动可增强小鼠海马齿状回SYP阳性表达水平，增强突触结构和功能的可塑性，提示PSD95、SYP蛋白与突触可塑性密切相关。本研究显示，HIE小鼠海马组织中PSD95、SYP蛋白水平显著低于假手术组，而RIPoC可增加HIE小鼠海马组织中PSD95、SYP蛋白水平，表明RIPoC可能通过促进PSD95、SYP蛋白表达，增加HIE小鼠的突触可塑性。

tPA表达于具有重塑再生能力的海马神经元，不仅可催化纤溶酶原转化为纤溶酶降解神经胶质抗原2核心蛋白，为轴突再生提供有利环境，还可通过不依赖于纤溶酶原激活的方式促进神经元生存及轴突再生[22]。研究[23]证实，tPA被突触前膜表面的p11调节激活后，可调控Pro-BDNF向成熟BDNF转化，减少Pro-BDNF与P75结合，抑制神经元凋亡；同时促进BDNF与TrKB结合，促进海马神经再生及海马突触可塑性，实现海马功能重塑。本研究发现，模型组小鼠海马组织p11、tPA、BDNF、TrKB蛋白表达显著低于假手术组，Pro-BDNF表达显著高于假手术组，推测HIE小鼠海马组织中p11/tPA通路被抑制，Pro-BDNF向BDNF的转化减弱，可能与HIE小鼠突触重塑降低及神经系统功能损伤有关。而RIPoC组小鼠海马组织中p11/tPA/Pro-BDNF/BDNF/TrKB通路各相关蛋白表达趋势均与模型组相反，提示RIPoC可激活HIE小鼠海马组织中p11/tPA通路，促进Pro-BDNF向BDNF转化，进一步促进BDNF/TrKB通路活化，这可能是其促进突触再生、提高突触可塑性的潜在机制。

综上所述，RIPoC可能通过激活p11/tPA通路，促进Pro-BDNF向BDNF转化及BDNF/TrKB通路活化，进而促进突触相关蛋白表达，提高HIE小鼠海马突触可塑性。但神经元突触再生及重塑的机制及靶标分子相对复杂，本研究未设置通路抑制剂进行研究，有待后续继续研究。