丙型肝炎病毒感染者血清微小核糖核酸665和224 的表达及其对肝癌的诊断价值

赵婧 魏巍 李会平 杜晓溪 曹明 王楷翔

1 河北省唐山市中心血站检验科，唐山 063000；2 河北省唐山市人民医院检验科，唐山 063000；3 河北省保定市人民医院检验科，保定 071000

HCV 持续感染可导致慢性丙型肝炎（CHC）、肝硬化甚至是肝癌，严重影响人类生命健康[1]。 微小核糖核酸 （miR） 作为一类新型的基因调控分子，在HCV 感染发生发展的不同阶段存在不同的异常表达， 研 究 发现，miR-665 及 miR-224 表 达 水 平 与HCV 的感染和致病密切相关[2-3]。本研究通过检测丙型肝炎患者血清miR-665 及miR-224 表达水平，分析其对肝癌的诊断价值，现报告如下。

对象与方法

一、研究对象

选取 2017年 1月至 2020年 5月保定市人民医院收治的130例 HCV 感染患者， 其中男性72例，女性 58例，年龄（49.25±9.70）岁，范围 28～68岁。 130例HCV 感染者根据疾病类型分为CHC 组54例，肝硬化组46例和肝癌组30例。纳入标准：①符合《丙型肝炎防治指南》[4]中CHC、肝硬化和肝癌的诊断标准； ②患者均来源于HCV 感染。 排除标准：①其他类型感染性疾病、恶性肿瘤及自身免疫性疾病；②妊娠、哺乳期女性。 另选择同期健康体检者共60 名作为对照组， 包括男性32 名， 女性28名，年龄（48.62±9.35）岁，范围 30～65岁。 本研究经保定市人民医院伦理委员会审批通过 （伦理审批号：2017012），并与研究对象签署知情同意书。

二、实验室指标检测

所有研究对象均于入院未治疗时或体检时采集空腹静脉血5 mL 置于未加抗凝剂的离心管中，3 000 r/min（离心半径12.5 cm）离心10 min 分离血清，使用SLAN96P 型荧光定量PCR 仪和试剂（上海宏石公司）检测 HCV RNA、miR-665 及 miR-224。 根据HCV RNA 的检测结果，＜103IU/mL 为低病毒载量，103～106IU/mL 为中病毒载量，＞106IU/mL 为高病毒载量。 miR-665 引物设计：上游：5'-GCTAGTCT GATCACTAGTAG-3'，下游：5'-AGCACTCATGCGTG TACG-3'；miR-224 引物设计：上游：5'-GCTACTCTG ATGACGAGTCG-3'，下游：5'-ACGATTCATGACTAT GTG-3'。逆转录反应体系为 15 μL：5 μL RNA 模板，3 μL U6 及 miR 特异性茎环引物，0.15 μL 100 mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μL 逆转录酶，1.50 μL反转录缓冲液，0.19 μL RNase 抑制剂，4.16 μL 双蒸水。 PCR 总反应体系为 20 μL∶1 μL 引物及探针Mix，10 μL TaqMan 通用混合物溶液，1.33 μL 反转录产物互补 DNA，7.67 μL 双蒸水； 扩增条件为：95 ℃变性 15 s、60 ℃退火 60 s、72 ℃延伸 60 s，进行 45 个循环。 以 U6 为内参，每组样本重复 3 次，采用 2-ΔΔCt法计算 miR-665 及 miR-224 水平。 使用贝克曼化学发光仪检测肝纤维化四项 [Ⅲ型前胶原(PⅢNP)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、层黏连蛋白(LN)、透明质酸酶(HA)]及甲胎蛋白（AFP）水平；贝克曼生化分析仪检测ALT 及AST 水平。

三、肝脏组织病理检查

患者平卧位或左侧卧位，通过彩色多普勒超声诊断系统引导， 经皮穿刺获取长度＞1 cm 的肝组织送检。 肝纤维化程度采用Metavir 评分进行判断，分为F0（无纤维化），F1（局限性汇管区纤维增生，窦周和小叶内纤维化），F2 （纤维化扩大至汇管区周围，肝小叶结构保留），F3 （纤维化伴小叶结构紊乱，无肝硬化），F4（早期肝硬化）。

四、统计学方法

采用SPSS20.0 统计软件分析，符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。 计数资料采用例数和率表示，组间比较采用χ2检验。 应用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清 miR-224、miR-665 及 AFP水平诊断肝癌的价值，miR-224、miR-665 及 AFP 三项联合诊断为并联试验（三项联合检测中有1 项为阳性即判定为阳性）。 P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、基本情况

CHC 组、肝硬化组、肝癌组和对照组间ALT 和AST 水平比较差异有统计学意义 （F=8.28 和7.79，P＜0.001），两两比较发现，与对照组比较，肝癌组、肝硬化组和 CHC 组 ALT （q=12.37、14.15、10.32）及AST（q=11.81、13.62、8.73）水平均较高，差异均有统计学意义（P 均<0.001）。 四组间性别、年龄、体质指数及HCV RNA 差异均无统计学意义 （P 均>0.05）。具体结果见表1。

表1 CHC 组、肝硬化组、肝癌组和对照组基本情况比较

二、血清 miR-665、miR-224、AFP 及肝纤维化四项水平比较

CHC 组、 肝硬化组、 肝癌组和对照组的血清miR-665、miR-224、AFP 及肝纤维化四项 （PⅢNP、CⅣ、LN、HA） 水平比较差异均有统计值意义 （F=16.18、11.52、21.63、9.71、15.84、8.25 和 14.39，P 均＜0.001）。 与对照组比较，肝癌组、肝硬化组和 CHC 组血清 miR-665（q=17.39、13.84、10.25）、miR-224（q=10.29、12.65、12.85）、AFP（q=9.94、14.27、9.62） 及 肝纤维化四项 （PⅢNP、CⅣ、LN、HA）（肝癌组：q=15.98、9.81、9.41 和 33.63， 肝硬化组：q=9.51、8.80、18.42 和 11.14，CHC 组：q=8.71、16.41、10.24 和9.61）水平均较高（P 均<0.001），且肝癌组血清 miR-665、miR-224 及 AFP 水平均明显高于 CHC 组（q=17.11、15.12 和 30.92） 和肝硬化组 （q=17.00、14.97 和28.74），差异均有统计学意义（P 均<0.001）。 肝硬化组血清CⅣ和HA 水平明显高于肝癌组（q=13.27 和16.94） 和 CHC 组 (q=11.53 和 18.15，P 均<0.001）。CHC 组和肝硬化组血清 miR-665、miR-224、AFP、PⅢNP 及 LN 水平均无统计学差异（P 均>0.05）。 具体结果见表2。

表2 不同组别患者血清miR-665、miR-224、AFP 及肝纤维化四项水平比较（）

表2 不同组别患者血清miR-665、miR-224、AFP 及肝纤维化四项水平比较（）

注：miR：微小核糖核酸；AFP：甲胎蛋白；CHC： 慢性丙型肝炎；PⅢNP：Ⅲ型前胶原；CⅣ：Ⅳ型胶原；LN：层黏连蛋白；HA：透明质酸酶；与对照组比较，a：P<0.001；与 CHC 组比较，b：P<0.001；与肝硬化组比较，c：P<0.001

组别例数（例） miR-665 miR-224 AFP（ng/mL） PⅢNP（ng/mL） CⅣ（ng/mL） LN（ng/mL） HA（ng/mL）对照组 60 1.05±0.27 0.16±0.05 9.75±2.84 5.37±1.92 20.73±6.15 11.36±4.28 50.41±15.39 CHC 组 54 2.28±0.93a 0.85±0.26a 45.80±10.36a 10.74±5.26a 81.62±24.71a 38.62±10.24a 342.20±75.26a肝硬化组 46 2.33±0.96a 0.91±0.32a 51.72±11.45a 11.35±6.50a 166.74±68.20ab 42.73±15.20a 740.52±106.37ab肝癌组 30 6.74±1.52abc 1.95±0.84abc 364.28±35.70abc 12.38±8.52a 115.28±41.27abc 38.10±11.35a 529.16±87.40abc F 值 16.18 11.52 21.63 9.71 15.84 8.25 14.39 P 值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

三、 不同特征HCV 感染患者血清miR-665 及miR-224 表达水平比较

表3 显示， 不同病毒载量组别的血清miR-665及miR-224 表达水平差异有统计学意义 （F=14.83、8.71，P 均＜0.001），其中高病毒载量组血清 miR-665及miR-224 表达水平明显高于中病毒载量组（q=16.37和 21.52）和低病毒载量组（q=10.37 和13.52），差异均有统计学意义（P 均<0.001），且中病毒载量组血清miR-665 及miR-224 表达水平明显高于低病毒载量组（q=11.24 和 8.53 ，P 均<0.001）。另外，不同肝纤维化分期组的血清miR-665 及miR-224 表达水平差异有统计学意义（F=17.62，11.18，P 均＜0.001），其中 F3～F4 期血清 miR-665 及 miR-224 表达水平明显高于 F0 期 （q=24.638 和 14.413） 和 F1～F2 期（q=18.52 和 11.40）， 差异均有统计学意义 （P 均<0.001），F1～F2 期血清 miR-665 及 miR-224 表达水平明显高于 F0 期（q=13.71 和 10.61，P 均<0.001）。 具体结果见表3。

表3 血清miR-665 及miR-224 在不同特征HCV 感染者中的表达水平（）

表3 血清miR-665 及miR-224 在不同特征HCV 感染者中的表达水平（）

注：miR：微小核糖核酸；HCV RNA<103 IU/mL 为低病毒载量；103~106 IU/mL 为中病毒载量；>106 IU/mL 为高病毒载量；与低病毒载量组比较，a：P <0.001；与中病毒载量组比较，b：P <0.001；与 F0 期比较，c：P <0.001；与 F1～F2 期比较，d：P <0.001

肝纤维化分期低（n=34） 中（n=57） 高（n=39） F 值 P 值 F0（n=29） F1～F2（n=56） F3～F4（n=45） F 值 P 值miR-665 1.82±0.61 2.75±0.94a 6.58±1.40ab 14.83 <0.001 1.51±0.48 2.90±0.96c 6.83±1.62cd 17.62 <0.001 miR-224 0.51±0.13 1.32±0.48a 2.05±0.86ab 8.71 <0.001 0.35±0.08 1.40±0.52c 2.36±0.90cd 11.18 <0.001项目 病毒载量

四、miR-665、miR-224 及 AFP 诊断肝癌的价值

miR-665、miR-224 及 AFP 三项联合诊断肝癌的曲线下面积为0.963， 明显高于单项miR-665、miR-224 及 AFP（0.851、0.815 及 0.920）；同时其灵敏度和特异性为99.2%和90.3%， 也优于三项单项检测结果（灵敏度和特异性：miR-665 分别为81.3%和 86.2%，miR-224 分别为 83.7%和 75.8%，AFP 分别为93.6%和87.5%）。 见表4。

表4 miR-665、miR-224 及 AFP 诊断肝癌的价值

讨 论

miR 是一类小分子非编码RNA，在CHC 发展、肝细胞再生和功能调节方面发挥着重要的作用，与肝细胞癌的发生和发展有关[5]。 近期研究发现，miR-665 及miR-224 表达水平在肝细胞癌中的表达与肿瘤细胞増殖、迁移、侵袭能力及预后相关，可促进肝癌细胞增殖、细胞周期和凋亡，有望作为肝癌诊断、预后预测的标志物和治疗靶点[6-7]。 同时miR-665 及miR-224 具有稳定性好、 特异性高、 易于检测等优点。 因此，本研究选择miR-665 及 miR-224 作为研究指标，以期为肝癌的诊断及治疗提供帮助。

一、血清miR-665 及miR-224 表达水平随着丙型肝炎患者疾病进展而升高

本研究显示，肝癌组、肝硬化组和CHC 组血清miR-665 及miR-224 表达水平均明显高于对照组，且肝癌组血清miR-665 及miR-224 表达水平均明显高于CHC 组和肝硬化组， 提示 miR-665 及miR-224 可能参与丙型肝炎的发生发展过程。An 等[8]研究发现，miR-224 通过调节多种信号通路在肝癌细胞的生长、增殖、侵袭和迁移中起到促进作用。 另有研究指出，miR-665 与肝癌患者的临床病理特征和不良预后呈正相关，可能成为肝癌患者治疗的新诊断标志物和靶点[9]。本研究显示，血清miR-665 及miR-224 表达水平随着肝纤维化分期的增高而逐渐升高， 说明它们与HCV 感染患者的病毒传染性和肝纤维化程度密切相关。

二、血清 miR-665 和 miR-224 联合 AFP 对肝癌有良好的诊断价值

AFP 是目前诊断原发性肝癌的经典肿瘤标志物。 而据 Mohamed 等[10]研究发现 miR-665 对肝癌的诊断也具有较好的灵敏度和特异性，可作为肝癌诊断的一个有前途的生物标志物。 同时，Lin 等[11]也发现早期肝癌患者血清miR-224 水平明显高于肝硬化、慢性肝炎和健康对照者，认为miR-224 是检测早期肝癌的一个潜在的生物标志物。本研究ROC 曲线显示，miR-665 及miR-224 对肝癌诊断均具有较好的价值， 联合AFP 诊断肝癌的曲线下面积最大，说明miR-665 及miR-224 表达水平可诊断肝癌的生物学标志物，其联合AFP 诊断肝癌的效能较高。

综上所述， 随着病情的进展，HCV 感染所致相关肝炎患者血清miR-665 及miR-224 表达水平明显升高， 其联合AFP 对诊断HCV 感染导致的肝癌具有较好的价值。 但本研究为单中心的临床分析，影响HCV 感染及肝癌发生发展的混杂因素较多，其结果可能存在偏倚，未来仍需扩大样本进行更深入的研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明赵婧：论文撰写和修改；魏巍、李会平、曹明：实验结果的检测及数据收集；杜晓溪：实验结果的统计分析；王楷翔：论文设计及实验指导