合并及非合并间质性肺病的RA、DM/PM、SSc患者血清TGF-β1和SP-D水平对比观察

蒋真，李向培，刘娟，白文花

1 南京医科大学附属淮安市第一人民医院免疫风湿科，江苏 淮安 223300；2 徐州医科大学附属淮安医院免疫风湿科；3 中国科学技术大学附属安徽省立医院风湿科

结缔组织病（CTD）是指结缔组织受累的疾病，包括类风湿关节炎（RA）、皮肌炎/多发性肌炎（DM/PM）、系统性硬化症（SSc）等多种疾病。间质性肺病（ILD）是不同CTD 常见并发症，也是影响患者预后的重要因素。RA、DM/PM、SSc 有不同ILD 患病率和严重程度，其中DM/PM 最易合并严重ILD。CTD 相关ILD（CTD-ILD）目前尚无有效的治疗方法，但早期诊断、积极治疗可明显改善预后。转化生长因子β（TGF-β）是系统性硬化症相关间质性肺病（SSc-ILD）发病的关键介质［1］。TGF-β 信号活化招募免疫细胞，产生更多的TGF-β。TGF-β 增多导致成纤维细胞分化、转化为肌成纤维细胞，刺激细胞外基质的合成、抑制基质金属蛋白酶的合成［2］。在SSc-ILD 患者肺组织TGF-β 调节基因表达上调［3］。表面活性蛋白D（SP-D）是主要由肺泡Ⅱ型细胞分泌的一种表面活性蛋白，功能是减少肺泡气/液表面张力，阻止小气道塌陷［4］。SP-D 反映了毛细血管/肺泡屏障的损伤程度［5］。ILD 和SSc-ILD 患者血清SP-D 水平增加，可能反映了SSc 相关ILD 的严重程度［6］。尽管文献报道多种CTD-ILD 标志物，但肺纤维化和肺损伤标志物TGF-β、SP-D 在不同ILD 中的表达水平差异如何尚不明确。本研究选取64 例CTD 患者（包括RA 12 例、DM/PM 26例、SSc 26 例），比较了合并及非合并ILD 的RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D 水平，旨在为临床对CTD 并发ILD 的诊断和病情判断提供参考指标。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019 年3 月—2020 年3 月淮安市第一人民医院收治的CTD 患者64 例。纳入标准：所有患者年龄≥16 周岁。RA 诊断参照2009年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟（ACR/EULAR）联合制定的分类标准；DM/PM 诊断参照1975 年Bohan 和Peter 分 类 标 准；SSc 诊 断 参 照2013 年ACR/EULAR 联合制定的分类标准。ILD 诊断参照Fleischne 学会命名委员会关于ILD 胸部高分辨CT（HRCT）术语的定义［7］。排除标准：所有患者均排除患有上述三类疾病中的两种或三种疾病、排除合并其他自身免疫性疾病、排除合并肿瘤和（或）感染性疾病患者、排除合并其他肺部疾病。64例CTD 患者中，包括RA 12 例、DM/PM 26 例、SSc 26 例。RA 患者12 例［合并ILD（RA-ILD）5 例、非合并ILD 7例］，男0例，女12例；年龄（53.6±12.8）岁；病程84.00（11.00～210.00）个月。DM/PM 患者26例［合并ILD（DM/PM-ILD）19 例、非合并ILD 7 例］，男8 例，女16 例；年龄（45.5 ± 17.2）岁；病程12.00（4.75～48.00）个月。SSc 患者26 例［合并ILD（SSc-ILD）22 例、非合并ILD 4 例］，男2 例，女24 例；年 龄48.0（29.8～54.0）岁；病 程42.0（17.0～87.0）个月。本研究取得淮安市第一人民医院伦理委员会同意，所有患者签署知情同意书。

1.2 血清TGF-β1、SP-D 检测方法 采用ELISA法。抽取治疗前活动期患者清晨空腹肘静脉血，离心获取血清，标本按照1∶11 稀释，即25 µL 血清+ 250 µL 稀释液；标准品：原液浓度100 ng/mL，倍比稀释（用稀释液稀释），溶解后需静置15 min；洗液1∶10 稀释（50 mL 原液+ 450 mL ddH2O）。实验过程：1.每孔加100 µL 标本、标准品或空白对照，在摇床上室温孵育2 h；2.洗板（5 次）后颠倒板子，倒尽液体，每孔加入100 µL生物素标记的抗体，在摇床上室温孵育1 h；3.洗板（5 次）后颠倒板子，倒尽液体，每孔加入100 µL HRP-抗生蛋白链菌素复合物，在摇床上室温孵育1 h；4.洗板（5 次）后颠倒板子，倒尽液体，避光每孔加入100 µL 底物，室温孵育15 min，孵育过程中避免摇晃板子；5.每孔加入100 µL 终止液；6.设定酶标仪在450 nm 波长处，检测每孔吸光度值；7.根据7 个标准品浓度及吸光度值（OD 值），绘制标准曲线及标准曲线方程；8.根据上述标准曲线计算每个标本浓度。

1.3 统计学方法 采用SPSS26.0统计软件。符合正态分布的计量资料以-x±s表示，组间比较采用t检验或方差分析；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whiney 检验或Kruskal-Wallis 检 验。P＜0.05 为 差 异 有 统 计 学意义。

2 结果

2.1 RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D 水平比较 RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D水平见表1，由表1 可知，RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D 水平比较均无统计学差异，P均＞0.05。

表1 RA、DM/PM、SSc患者血清TGF-β1和SP-D水平［ng/mL，M（P25，P75）］

2.2 合并及非合并ILD 的RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D 水平比较 合并及非合并ILD 的RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D 水平比较 见表2。

表2 合并及非合并ILD的RA、DM/PM、SSc患者血清TGF-β1和SP-D水平比较［ng/mL，M（P25，P75）］

3 讨论

RA 是常见的CTD，较易合并ILD，部分患者病情较重，而SSc 和DM/PM 虽然发病率不高，但易合并ILD，且多为严重ILD，预后不良。CID-ILD 是影响不同CTD 预后的重要并发症之一，特别是DM/PM-ILD 合并的快速进展性ILD（RP-ILD）短期内可导致患者呼吸衰竭、死亡。而ILD 标志物可提供重要的诊断和预后判断信息，具有重要的临床价值。CTD-ILD 的标志物文献报道很多，如炎性肌病相关ILD 标志物：各种肌炎特异性抗体、肌炎相关抗体［8］，SSc-ILD 标志物抗拓扑异构酶抗体［9］，RA-ILD 标志物抗CCP 抗体［10］，另外还有表观遗传标志物miRNAs［11-12］等。这些标志物有重要的临床意义，但可能只与相应的CTD-ILD 相关，是否存在与不同CTD-ILD 均相关的标志物尚不明确。

TGF-β 参与各种组织纤维化（包括SSc 肺纤维化）发病，而SP-D 直接由肺组织分泌，被认为是肺损伤重要标志物之一，因此这两个标志物可能与CTD-ILD 相关性更强，成为本次研究关注的对象。TGF-β1可能在不同CTD 中与ILD 的相关性不同。TGF-β 是一个具有多种功能的细胞因子，在造血、血管生成、细胞增殖、分化、迁移和凋亡方面均发挥作用，对T 细胞作用的研究显示其可能具有促炎或抗炎作用。TGF-β 有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三种类型，也有三种TGF-β 配体，TGF-β1与配体结合后介导纤维化和疤痕形成，而TGF-β3可能参与无疤痕愈合［13］。另外研究［14］发现，TGF-β1与肝癌侵袭有关，RA 具有肿瘤样的滑膜增殖和滑膜骨侵蚀，TGF-β1在RA 非合并ILD 患者中高表达是否与此相关值得进一步研究。ZHU 等［15］发现，RA 中TGF-β1通过TGF-β1/Smad 信号通路促进成纤维细胞样滑膜细胞迁移和侵蚀。研究［16］发现，TGF-β1+ 869C/T 多态性增加北印度人RA 的易感性，并且TGF-β1的多态性与RA 疾病活动性相关，T 等位基因增加与高的炎症活性、不良功能结局和更差的存活率相关，而CC 基因型或C 等位基因具有保护作用。因此，TGF-β1与RA 的相关性可能与其促炎和促进滑膜增殖和骨侵蚀有关。而TGF-β1在DM/PM 和SSc患者中的促纤维化作用可能与其在特定环境下与不同配体结合或与其基因的多态性有关，这值得进一步研究。SP-D 是由肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌的一种表面活性蛋白，参与降低肺泡气/液表面张力、防止小气道塌陷，血清中这些肺特异性蛋白水平反映了毛细血管/肺泡屏障的损伤程度［6］。在肺损伤的情况下，血清中SP-D 水平增加至少部分是由于产生增加和（或）渗入外周血所致［17］，因此可以作为ILD 损伤和预后判断的一个标志物，但文献研究大多来自SSc 相关ILD，少见在不同CTD-ILD 中表达的比较研究。

本研究发现，CTD 非合并ILD 者血清TGF-β1水平较CTD-ILD者升高，RA非合并ILD血清TGF-β1水平也较RA-ILD 者升高，因此TGF-β1似乎与CTD 相关的ILD 无明显相关性。我们前期研究［18］发现，在RA、DM/PM、SSc 中，ILD 的发病率和严重性按此顺序递增。本研究发现，RA 患者血清TGF-β1水平较DM/PM、SSc 者升高，RA 非合并ILD 者较DM/PM 非合并ILD 者、SSc 非合并ILD 者升高，支持TGF-β1与CTD-ILD 不相关这一观点。因此，TGF-β1在不同CTD 与ILD 相关性不同，如在RA 中可能与ILD 相关性不大，而在DM/PM 和SSc 中可能与ILD 相关，上述结果可能与TGF-β 有3 种类型和3 种配体，以及TGF-β1的多态性有关［13-16］。本研究还发现，CTD-ILD者血清SP-D 水平较CTD 非合并ILD 者升高，各CTD-ILD 者也较相应CTD 非合并ILD 者升高，并且RA-ILD 组较RA 非合并ILD 组明显升高，差异有统计学意义，支持SP-D对CTD-ILD的作用，并且对不同CTD-ILD的作用强度可能不同。文献［19-21］报道，SP-D水平也受SP-D 基因多态性的影响。本文结果显示，血清SP-D 水平在不同CTD-ILD 中的差异可能与此有关。

总之，合并及非合并ILD 的RA、DM/PM、SSc 患者血清TGF-β1和SP-D水平存在差异，检测两指标有助于不同CTD-ILD的病情判断。