靶向融合肽对裸鼠顺铂耐药卵巢癌移植瘤生长的抑制作用及其机制

袁金，康佳丽，王小霞

华南理工大学附属第二医院妇产科，广州 510180

卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发生与癌基因的激活、抑癌基因的失活以及异常细胞信号通路的激活有关［1-6］。大多数卵巢癌患者易复发，对化疗有耐药性，铂类耐药患者预后差，对进一步化疗的反应率低，且中位生存期低于12 个月［7］。本课题组前期研究将可特异结合卵巢癌细胞的短肽［8］与广谱的细胞穿膜肽、可诱导肿瘤细胞凋亡的丝裂原活化蛋白激酶激酶6 的组成性突变体重组，构建成靶向融合肽（MAP2K6-FP）［9］。前期研究表明，MAP2K6-FP 能在体外水平增加耐药性卵巢癌细胞对顺铂（DDP）的敏感性。本实验拟从体内水平研究MAP2K6-FP 对顺铂耐药细胞的生长抑制作用。本研究以裸鼠为实验对象，腹腔注射人卵巢癌顺铂耐药细胞株（SKOV3/DDP）制备顺铂耐药卵巢癌移植瘤模型，注射1 周后尾静脉注射0.25 mg/kg的MAP2K6-FP，观察MAP2K6-FP 对裸鼠顺铂耐药卵巢癌移植瘤生长的抑制作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 MAP2K6-FP及SKOV3/DDP细胞 MAP2K6-FP为本课题组前期通过原核表达的方法成功构建，保存于-20 ℃环境中。SKOV3/DDP 细胞购于北京市肿瘤医院。用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640 培 养 基 培 养 在37 ℃、5%CO2培 养箱中。

1.2 实验动物 SPF 级雌性BALB/C nu/nu 裸鼠14 只，4～6 周龄，体质量（14 ± 0.96）g，购自广东省医学实验动物中心［SCXK（粤）2008-0002］，在广州医科大学实验动物中心［YXK（粤）2010-0104］进行SPF 级饲养（实验动物合格证号：440072000，动物实验证明编号：00066334）。斑马鱼受华中科技大学生命科学技术学院惠赠，并以自然成对交配的方式在本实验室进行繁殖。依照国际AAALAC 的要求，其饲养条件为28 ℃，pH 值6.9～7.2，硬度53.7～71.7 mg/L CaCO3 的养鱼用水（200 mg 速溶海盐加入1 L 反渗透水以维持为480～510 µS/cm电导率）。

1.3 主要试剂 RPMI1640 培养基和胰蛋白酶-EDTA（0.25%∶0.2%）购自美国Sigma 公司；多克隆兔抗人VEGFR-3、LYVE-1、EGFR3 抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；鼠抗人D2-40及β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京博奥森生物科技有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒和SP 试剂盒购自北京碧云天生物有限公司。

1.4 裸鼠顺铂耐药卵巢癌模型制备、MAP2K6-FP注射方法及移植瘤、淋巴管相关指标观察 ①裸鼠顺铂耐药卵巢癌模型制备、MAP2K6-FP 注射方法：SKOV3/DDP 细胞经胰酶消化后，用PBS 洗3次，然后用生理盐水稀释细胞悬液。每只裸鼠腹腔 内 注 射 200 µL 的 SKOV3/DDP 细 胞（5×106/mL）。腹腔内注射SKOV3/DDP 细胞1 周后，将制模成功的裸鼠随机分为两组（各7 只）。观察1 组尾静脉注射0.25 mg/kg 的MAP2K6-FP，每周2 次；对照1 组尾静脉注射5 mL/kg 的生理盐水，每周2次；共注射4 周。②裸鼠腹围测量及腹水量、转移器官数、瘤结节数、瘤体重量记录：每周测量3 次裸鼠腹围。治疗1 个月后（腹腔注射细胞后5 周），统一处死全部裸鼠，解剖并记录裸鼠腹水量、肿瘤播散器官数（如大网膜、肠系膜、腹壁、横膈、肝、脾、肺和肾等有肿瘤生长的部位）和瘤结节数量（腹腔可见数个米粒至豌豆大小的瘤体）。剥离出移植瘤（肿瘤结节及裸鼠肝、脾、肾、肺等主要脏器），石蜡包埋，用作后续免疫组化实验。③裸鼠移植瘤中血管内皮生长因子特异性受体3（VEGFR-3）、淋巴管内皮透明质酸受体-1（LYVE-1）、唾液酸糖蛋白（D2-40）及表皮生长因子受体3（EGFR3）检测：a.VEGFR-3、LYVE-1、D2-40：采用免疫组化SP 法。以PBS 缓冲液作为阴性对照，按照试剂盒说明书进行操作。在400 倍光学显微镜视野下，每100 个肿瘤细胞中胞质及胞膜呈棕黄染色的细胞比例＜10%为阴性，≥10%为阳性。肿瘤组织中VEGFR-3、LYVE-1、D2-40 的平均灰度值由图像分析系统全自动测定。VEGFR-3、LYVE-1以阳性率表示（棕黄色颗粒占比），D2-40 以个/视野表示。b.EGFR3：采用蛋白印迹法。取移植瘤组织，用RIPA 裂解液裂解并提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白质浓度。取30µg 进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。继之在4 ℃进行200 mA 恒流转膜2 h。经1 h 室温封闭后，与EGFR3 一抗（1∶1 500）4 ℃孵育过夜，并以β-actin 作为内参照（1∶2 000）。次日二抗（1∶5 000）室温孵育1 h 后将PVDF 膜经化学发光剂处理，于凝胶成像系统中曝光并采集图像，各条带的平均A 值由Image J 图像分析软件测定。EGFR3以相对表达量表示。

1.5 斑马鱼淋巴管生成情况观察 将所收集的斑马鱼卵置于培养皿的Egg water 中，在普通体视显微镜下观察斑马鱼的生长情况。斑马鱼以自然成对交配的方式进行繁殖，受精后24 h后更换Egg water，并将鱼卵放置于12 孔板中，每孔18～20 枚。受精后2、3、4 d 时更换培养液，受精后4 d 将斑马鱼卵随机分成2 组（每组20 尾），观察2 组加入20 mmol/L 的MAP2K6-FP，对照2 组加入等量生理盐水，后置于28.5 ℃的培养箱中培养1 h。把斑马鱼置入冰水中麻醉，将麻醉的斑马鱼胚胎置于滴加了3%的甲基纤维素的透明载玻片上，观察两组斑马鱼淋巴管生成情况，并照相。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以-x±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组裸鼠腹围、腹水量、转移器官数、瘤结节数、瘤体重量比较 裸鼠腹围、腹水量、转移器官数、瘤结节数、瘤体重量比较见表1。

表1 两组裸鼠腹围、腹水量、转移器官数、瘤结节数、瘤体重量比较（±s）

表1 两组裸鼠腹围、腹水量、转移器官数、瘤结节数、瘤体重量比较（±s）

注：与对照1组比较，*P＜0.05。

组别观察1组对照1组腹围（mm）73.00±1.23*84.00±3.60腹水量（mL）0.29±0.03*1.16±0.15转移器官数（个）2.80±0.44*7.20±0.44瘤结节数（个）44.60±3.51*115.00±4.85瘤体重量（g）0.30±0.03*1.28±0.33

2.2 两组裸鼠移植瘤中VEGFR-3、LYVE-1、D2-40、EGFR3 表达比较 观察1 组VEGFR-3 阳性率27.1%、LYVE-1 阳性率32.3%、D2-40（3.10±0.72）个/视 野、EGFR3 0.22 ± 0.01，对 照1 组 分 别 为73.8%、80.3%、（9.31 ± 1.68）个/视 野、0.34 ±0.02，两组比较，P均＜0.05。

2.3 两组斑马鱼淋巴管生成情况比较 观察2 组鱼腹部不能形成连续的管腔，对照2 组鱼腹部可见三条管腔伴行。

图1 斑马鱼外形和荧光镜下斑马鱼淋巴管情况

3 讨论

卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发生与癌基因的激活、抑癌基因的失活以及异常细胞信号通路的激活有关［6］。大多数卵巢癌患者易复发，对化疗有耐药性，铂类耐药患者预后差，对进一步化疗的反应率低，且中位生存期低于12 个月［7］。获得性耐药已成为卵巢癌治疗中的一个重要问题，普遍存在化疗耐药（顺铂、紫杉醇等），部分原因是卵巢癌细胞线粒体内活性氧生成减少［10］。有研究［11］表明，卵巢癌化疗耐药性的原因可能是参与对化疗引起的DNA 损伤反应的修复通路的冗余，这些通路可能是并行作用的，如果负责触发铂化疗后细胞死亡的修复通路缺乏，另一种替代修复通路会补偿并驱动癌细胞修复损伤，导致化疗耐药性，因此推动DNA 修复通路对铂化疗或靶向治疗的敏感性，从而可以克服卵巢癌化疗耐药。卵巢癌患者对铂类化疗药产生耐药性具有复杂性，包括不同种类的疾病，目前远远没有被完全理解。因此，我们迫切需要研究卵巢癌的化疗耐药机制，以克服卵巢癌治疗效果差和患者预后不良的问题。

本课题组前期通过原核表达的方法成功构建MAP2K6-FP，其是一种特异性靶向卵巢癌的具有细胞杀伤力的融合肽，在体外水平能通过诱导卵巢癌细胞的自噬性死亡而增加其对DDP 的敏感性。本实验我们一方面构建顺铂耐药卵巢癌移植瘤模型，以便更清楚地观察MAP2K6-FP 对顺铂耐药卵巢癌在体内的作用，另一方面应用斑马鱼模式生物模型进一步验证MAP2K6-FP 在淋巴管发生过程所起的作用［12-13］。本实验发现，MAP2K6-FP 作用于顺铂耐药卵巢癌移植瘤后，观察1 组细胞的生长速度明显慢于对照1 组，腹围增长缓慢。至治疗结束后剖腹观察观察1组裸鼠腹水量明显小于对照1组，肿瘤播散器官数、瘤结节总数及瘤体总重量均明显低于对照1 组。这些大体观察结果均表明，MAP2K6-FP 能够抑制顺铂耐药卵巢癌移植瘤的生长。分析其机制，可能与肿瘤淋巴转移相关。

研究［14-17］显示，LYVE-1 和D2-40 是近些年来发现的两个重要的淋巴管标志物。相对肿瘤新生血管研究而言，卵巢癌的淋巴管转移方面的研究却甚少，长期以来对淋巴转移规律及处理重视不够，认识不深。在转基因鼠和其他体外模型中的研究已证实肿瘤主要通过表达于淋巴管内皮细胞上的VEGFR-3信号途径诱导淋巴管生成。而利用VEGF受体抑制剂来抑制肿瘤组织和淋巴结内的淋巴管新生能有效抑制早期肿瘤的转移［18-20］。本文结果显示，VEGFR-3、LYVE-1和D2-40 在淋巴管内皮细胞膜和胞质呈棕黄色，观察1组的阳性率均低于对照1组。观察1组D2-40为（3.10±0.72）个/视野，对照1组中为（9.31±1.68）个/视野，且管腔内未见红细胞填充。MAP2K6-FP作用于顺铂耐药移植瘤后，VEGFR-3、LYVE-1 和D2-40 表达均下降，提示MAP2K6-FP 能够一定程度抑制淋巴管生成。临床上卵巢癌的转移性极高并常见转移至腹部大网膜。这种迁移机制依赖于转移的肿瘤细胞对表皮生长因子受体家族相关基因的表达上调作用，尤其是增加EGFR3 的表达［17］。本研究中MAP2K6-FP 作用于顺铂耐药移植瘤，移植瘤组织中EGFR3 的表达较对照1 组低，提示MAP2K6-FP 能够抑制EGFR3的表达，抑制肿瘤转移。

本实验进一步发现，观察2 组20 mmol/L 的MAP2K6-FP 作用于斑马鱼后，可见明显的斑马鱼形态的变化，出现心包积液及胸导管分离的情况，在荧光体式显微镜下进行淋巴管的观察，可以观察到淋巴管的生成受到抑制，没有形成连续的管腔；而对照2 组的斑马鱼发育过程没有很大的影响，鱼腹部可见三条管腔伴行。实验结果提示MAP2K6-FP 能够抑制斑马鱼淋巴管的生成，进一步印证上述机制。

总之，MAP2K6-FP 可以抑制裸鼠顺铂耐药卵巢癌移植瘤生长，机制可能是通过抑制淋巴管生成而实现；斑马鱼淋巴管生成受MAP2K6-FP抑制可进一步印证上述机制。