分离自院内感染患者不同标本的KP生物被膜形成能力及对常用抗菌药物耐药率观察

税剑，向延根，石国民，喻容，潘建华

1 长沙市中心医院检验科，长沙 410004；2 南华大学附属长沙中心医院检验科

生物被膜是指细菌为适应周围环境，黏附于接触介质表面，不断繁殖并分泌大量胞外基质（多糖、蛋白、脂质、胞外DNA 等）将其紧紧包裹形成致密的、三维立体膜状结构［1-2］。细菌形成生物被膜后可以阻碍抗菌药物渗透，使细菌耐药性增加10～1 000倍，导致慢性感染迁延不愈，使临床抗感染变得更加棘手［3-4］。肺炎克雷伯菌（KP）是临床常见的条件致病菌，广泛存在于自然界，以及人体肠道、呼吸道、泌尿生殖道等处［5］。KP 生长条件要求低，适应能力强，常定植于机体或生物材料表面形成生物被膜，导致机体发生慢性持续性感染［6-7］。KP 耐药机制比较复杂，水解酶或钝化酶的产生、外膜孔蛋白的缺失、抗菌药物主动外排、抗菌药物作用靶点改变等均可导致KP耐药，而目前关于生物被膜形成强弱程度对KP 耐药性影响的研究较少。本研究选取96 株KP作为实验对象，采用结晶紫染色法检测菌株的生物被膜形成能力，另采用Vitek2Compact 全自动微生物鉴定/药敏分析系统进行细菌鉴定及药物敏感性试验，并比较了不同生物被膜形成能力的KP对常用抗菌药物的耐药率。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 96 株肺炎克雷伯菌分离自长沙市中心医院2021年6—9月院内感染患者各类标本，其中71株来源于患者呼吸道标本，18株来源于患者尿液，3 株来源于患者血液，2 株来源于患者腹水，2 株来源于患者分泌物。所有菌株均经法国生物梅里埃公司Vitek2Compact 全自动微生物鉴定/药敏分析系统鉴定到种。 质控菌株为ATCC27853、ATCC25922购自国家卫生健康委临床检验中心。

1.2 主要试剂及仪器 0.1%结晶紫染液、LB 培养基为北京索莱宝科技有限公司产品；血平板为郑州安图工程股份有限公司产品。Vitek2Compact 全自动微生物鉴定/药敏分析系统、GN 鉴定卡、ASTN335 药敏卡、比浊仪均为法国生物梅里埃公司产品；多功能酶标仪为深圳市汇松科技发展有限公司产品；台式恒温振荡培养箱为金坛市荣华仪器制造有限公司产品；恒温培养箱为赛默飞世尔科技有限公司产品；96 孔聚苯乙烯细胞培养板为无锡耐思生命科技股份有限公司产品。

1.3 KP生物被膜形成能力检测 采用结晶紫染色半定量法。参考文献［8-9］方法并作改进。将KP 转种至血平板上37 ℃环境下培养24 h，挑取单个菌落接种至5 mL 的LB 液体培养基中，37 ℃条件下以200 r/min的速度振荡培养18 h，用LB液体培养基调整菌液为0.5麦氏浊度备用。吸取菌液200µL加入96 孔细胞培养板，每株菌做3 个复孔，3 个阴性对照孔每孔加入200 µL 的LB 液体培养基，37 ℃培养24 h。吸走液体培养基，生理盐水清洗培养孔3 次，去除浮游菌，自然晾干。每孔加入0.1%结晶紫200µL 染色15 min，弃去染液，流水缓慢冲洗3 次除去未结合的染料，自然晾干。每孔加入95%酒精200µL 脱色混匀10 min，酶标仪570 nm 处比色读取吸光度（A）值。KP 成膜能力分级，不成膜：A≤Ac；弱成膜：Ac＜A≤2Ac；中等成膜：2Ac＜A≤4Ac；强成膜：A＞4Ac。阴性对照的平均A值加上其标准差定义为Ac。

1.4 KP耐药性检测 采用法国梅里埃公司生产的Vitek2Compact 全自动微生物鉴定/药敏分析系统进行药敏试验。具体步骤：用无菌棉拭子取足够量的KP 纯菌落，放到试管的生理盐水里，用涡旋振荡器使其充分混匀，用电子比浊仪调整菌液浊度至0.5麦氏单位。取配好的0.5麦氏菌悬液145µL，加到另一装有3 mL 生理盐水的试管中。将鉴定试剂卡和鉴定用菌悬液放到试剂卡架上，药敏卡及药敏菌液放在鉴定卡的右边，将试剂卡架放到仪器中自动填充，24 h 后自动读取药敏结果。检测抗菌药物包括哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、美罗培南、妥布霉素、左氧氟沙星、米诺环素、复方新诺明、头孢他啶、头孢比肟、亚胺培南、阿米卡星、环丙沙星、多西环素、多粘菌素B，替加环素。药敏结果判定参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2020年标准进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计数资料用率（%）表示，比较采用Fisher确切概率法或χ2分割法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KP 生物被膜形成情况 不成膜菌株8 株（8.3%），结晶紫染色后吸光度值为0.154 3±0.006 9；弱成膜菌株14 株（14.6%），结晶紫染色后吸光度值为0.227 1±0.057 9；中等成膜菌株39 株（40.6%），结晶紫染色后吸光度值为0.527 4 ± 0.090 2；强成膜菌株35 株（36.5%），结晶紫染色后吸光度值为0.997 7 ± 0.447 5。KP 结晶紫染色结果，见图1。ICU 病房（包括综合ICU、EICU、RICU、神内ICU、神外ICU）分离出KP 37 株，其中34（91.9%）株能形成生物被膜；普通病房（包括呼吸内科、消化内科、肾内科、内分泌科、普外科、骨科、神经外科等非ICU 科室）分离出KP 59 株，其中54（91.5%）株形成生物被膜；ICU 病房分离出的KP 生物被膜形成能力与普通病房组比较，P＞0.05。

图1 KP结晶紫染色结果

2.2 KP 对常用抗菌药物的耐药率 KP 对左氧氟沙星、复方新诺明、环丙沙星、多西环素具有较高的耐药率，耐药率分别为44.8%、43.7%、50.0%、45.8%；对美罗培南、亚胺培南、阿米卡星、多粘菌素B、替加环素耐药率较低，耐药率分别为18.7%、18.7%、12.5%、1.0%、4.2%。

2.3 不同生物被膜形成能力的KP对常用抗菌药物的耐药率比较 不同生物被膜形成能力的KP 对哌拉西林/他唑巴坦（χ2=16.862，P=0.001）、头孢哌酮/舒 巴 坦（χ2=14.258，P=0.003）、氨 曲 南（χ2=9.431，P=0.024）、美罗培南（χ2=17.671，P=0.001）、复方新诺明（χ2=9.315，P=0.025）、头孢他啶（χ2=10.318，P=0.016）、头 孢 比 肟（χ2=9.088，P=0.028）、亚胺培南（χ2=14.663，P=0.002）、阿米卡星（χ2=15.918，P=0.001）、环丙沙星（χ2=9.070，P=0.028）、多西环素（χ2=9.031，P=0.029）的耐药率不同，差异具有统计学意义（P均＜0.05）。KP 对上述11 种抗菌药物的耐药率不随生物被膜形成能力增强而升高，其中弱成膜组菌株耐药率最高，高于各组菌株（P均＜0.05）；中等成膜组菌株耐药率（除亚胺培南外）高于不成膜组及强成膜组（P均＜0.05）；强成膜组菌株（除头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南、亚胺培南外）耐药率高于不成膜组（P均＜0.05）。

3 讨论

生物被膜是细菌为适应周围不利环境而出现的一种特殊生存形式，是细菌及其自身分泌的胞外基质组成的三维立体结构性生物群落。细菌生物被膜常导致感染迁延不愈，使慢性感染治疗变得更加棘手，临床上80%的慢性感染与生物被膜密切相关［10］，而且生物被膜通过各种机制增加细菌的耐药性。细菌生物被膜的形成主要包括三个阶段：一、浮游菌的聚集、黏附阶段；二、细胞外基质分泌、被膜形成阶段；三、生物被膜成熟、分散阶段［11-12］。有文献［3］报道，生物被膜内细菌对抗生素的耐药性比浮游菌高10～1 000 倍，其主要原因有两个：一、抗菌药物渗透障碍学说，生物被膜中含有大量蛋白质、多糖、胞外DNA 等物质，可以有效减缓抗菌药物的渗透，降低其中抗菌药物的浓度；同时生物被膜的某些组分可以结合抗菌药物，阻碍抗菌药物接触细菌。研究［13］证实，生物被膜组分如藻酸盐可以结合氨基糖苷类抗生素，从而阻碍妥布霉素等的渗透。二、营养限制学说，细菌形成生物被膜后，被膜底层细菌由于缺氧、缺营养，长期处于休眠状态（称之为饥饿细胞），这种状态下的细菌对抗菌药物不敏感［14］。文献［15］证实，环丙沙星可以渗透进入生物被膜内部，但不能有效杀灭生物被膜底层的细菌。在临床抗感染治疗中，有时会出现某种抗菌药物体外敏感，但是抗感染效果不尽如意，其主要原因可能是细菌形成了生物被膜，使该药物的抗感染效果降低所致。本研究通过96 孔细胞培养板体外构建生物被膜，发现绝大数KP 能够形成生物被膜，此结果与研究［16-17］结果相近。本研究还发现，不同成膜能力的KP 对部分抗菌药物的耐药性不同，但是耐药性与其成膜能力的强弱程度相关不明显。ALCÁNTAR-CURIEL 等［18］发现，KP 形成生物被膜影响其耐药性，但生物被膜形成能力强弱程度与耐药性不成线性相关。由此说明，KP 生物被膜形成可能对某种或某几种抗菌药物的抗菌活性产生影响，导致耐药性升高。而其他抗菌药物耐药性增加可能是由于其他耐药机制导致或其他耐药机制起主要作用所致。

KP 是临床常见的条件致病菌，由于近年广谱抗菌药物的大量使用甚至滥用，导致多重耐药菌不断出现，给临床抗感染治疗带来极大困难。本研究显示，KP 对左氧氟沙星、复方新诺明、环丙沙星、多西环素的耐药性较高，对美罗培南、亚胺培南、阿米卡星、多粘菌素B、替加环素保持较高的敏感性，此结果与马红叶等［19］的研究结果相近，结果提示KP耐药形式依然严峻，临床抗感染过程中应根据药敏结果慎用耐药性高的药物，抗菌药物使用过程中应结合药敏试验结果进行目标治疗。尤其对于泛耐药KP 感染的治疗，需要结合药物的最低抑菌浓度值进行联合用药。ICU 是综合性医院重要的抢救单元，住院患者病情严重、基础疾病复杂、免疫力低下。入院后通常会使用大量广谱抗菌药物进行抗感染治疗，从而诱导一系列耐药机制产生，导致KP对抗生素的敏感性降低；另外，ICU 患者通常需要进行一系列有创操作（气管插管、动静脉导管等）维持患者生命，这些有创操作破坏了机体的物理保护屏障，往往会增加细菌定植于生物材料表面或患者伤口创面的机会，从而形成生物被膜，阻碍抗菌药物渗透，导致慢性感染迁延不愈。KP 是临床常见的条件致病菌，容易定植在生物材料或机体表面形成生物被膜，导致抗生素敏感性下降。本研究发现，ICU 分离的KP 菌株生物被膜形成能力与普通病房菌株比较，差异不显著。由此说明，生物被膜不是引起ICU 病房KP 耐药性升高的主要因素，ICU病房KP 耐药性升高可能与入院后广谱抗菌药物的大量使用有关。

总之，KP 大多能形成生物被膜，对各种抗菌药物呈不同程度耐药，应加强医院感染管理，有效控制生物被膜感染；KP生物被膜形成不受菌株科室来源影响，且菌株生物被膜形成能力影响细菌耐药性，但耐药性与生物被膜形成能力强弱相关不明显，具体关系及机制还有待后续进一步研究。