微生物菌剂对烟草连作土壤理化性质及土壤胞外酶酶活性的影响

姜永雷，肖雨，邓小鹏，项岩所保，董华，马二登，李军营，陈颐*

微生物菌剂对烟草连作土壤理化性质及土壤胞外酶酶活性的影响

姜永雷1，肖雨2，邓小鹏1，项岩所保3，董华3，马二登1，李军营1，陈颐1*

1 云南省烟草农业科学研究院，云南省昆明市圆通街33号 650021；2 西南林业大学园林园艺学院，昆明 650224；3 云南省香料烟有限责任公司，保山 678000

【目的】为研究微生物菌剂对不同连作年限植烟土壤的影响。【方法】以不同连作年限植烟土壤为研究对象，研究微生物菌剂对植烟土壤理化性质、胞外酶活性以及烟草农艺性状的影响，旨在为缓解烟草连作障碍提供参考。【结果】（1）未添加微生物菌剂的土壤随连作年限增加，土壤养分含量有机碳（SOC）、全氮（TN）、有效磷（AVP）、铵态氮（NH4+-N）和硝态氮(NO3--N）呈降低趋势，土壤pH值呈下降趋势，介于5.0～6.4；土壤胞外酶过氧化物酶（PER）、酸性磷酸酶（ACP）、纤维二糖水解酶（CBH）活性不同程度下降；同时烟草长势变弱，株高、根、茎、叶鲜重和相同叶位叶片干重、鲜重、叶长和叶宽均呈降低，且均在连作8年达最低。（2）添加微生物菌剂后，土壤有机碳、全氮、有效磷、硝态氮和铵态氮含量呈上升趋势，土壤pH值呈上升趋势，介于6.0～7.1；土壤胞外酶活性得到不同程度改善。【结论】3种外源微生物均能改善土壤胞外酶活性，提高碳循环和氮循环能力，增加土壤养分，促进烤烟生长，缓解连作障碍。

微生物菌剂；连作；理化性质；酶活性

云南省烤烟连作现象严重[1]，影响了土壤的物理化学性质、土壤养分含量和土壤酶活性[2]，导致土壤微生物结构失衡、病虫多发[3]、烟株生长发育不良、品质和产量下降[4-5]。微生物菌肥不仅能增强根际土壤酶活性，改善土壤理化性质和微生物群落结构[6]，还能促进植物的光合效能，加强根系养分吸收，增加作物产量[7]。前人研究表明微生物菌肥能增加烤烟株高、降低病害[8]；枯草芽孢杆菌菌肥对马铃薯疮痂病具有较好的防效作用[9]；丛枝菌根真菌可以提高连作土壤酶活性，改善土壤微生物结构[10]。本研究以不同连作年限植烟土壤为研究对象，通过微生物菌剂处理，研究微生物菌剂对不同连作年限植烟土壤理化性质、胞外酶活性以及烟草的农艺性状等影响，为缓解烟草连作障碍，促进烟草种植业持续健康发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况和试验材料

试验于2020年5月至8月在云南省烟草农业科学研究院玉溪市研和试验基地（24°14′ N，102°30′ E，海拔1680 m）进行。试验地土壤理化性状：pH 6.40，有机质10.70 g/kg，全氮0.54 g/kg，全磷0.11 g/kg，全钾6.43 g/kg，有效磷 9.01 mg/kg，有效钾160.00 mg/kg，碱解氮82.00 mg/kg。

供试烟草品种为K326，由云南省烟草农业科学研究院提供。纯微菌剂主要成分为枯草芽孢杆菌、深绿木霉等，有效活菌数≥8.0亿个/g，由国家增产菌技术研究推广中心、中国农大农用生物制剂中试基地提供；恩格兰菌剂主要成分为枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌等，另含腐植酸、氨基酸、有机质等，有效活菌数≥20.0亿个/g，由湖南恩格兰生物科技有限责任公司提供；中微所菌液为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、塔宾曲霉等，有效活菌数≥10.0亿个/L，由中科院微生物研究所提供。

1.2 试验设计

采用盆栽试验，用30 cm×25 cm的聚乙烯塑料盆，装不同连作年限（1 a，3 a，5 a，8 a）植烟土壤5 kg，分别按1 g/kg土壤、0.4 g/kg土壤和1 mL/kg土壤的使用标准添加纯微、恩格兰、中微所菌剂，采用浇灌法，连续处理2次，每15 d1次，每次300 mL。如表1所示，对照组T：不添加微生物菌剂；处理组A：添加纯微菌剂；处理组B：添加恩格兰菌剂；处理组C：添加中微所菌剂，共16个处理，每个处理重复5次。

表1 试验设计

1.3 土壤采样

每处理采集3株烟株，采用抖根法收集根际表面土壤，将3次收集的土样混匀，放入冰盒中快速运送到实验室待测。实验室内将土壤样品过2 mm筛后，分成两份，一份风干后保存，用于测定土壤的理化性质；另一份于4℃低温密封保存，用于测定胞外酶活性。

1.4 测定方法

1.4.1 土壤理化性质指标测定

采用雷诺 PHs⁃3E酸度计按照土∶水=1:5测定土壤pH值，土壤有机碳（SOC）采用重铬酸钾容量法测定，总氮（TN）采用半微量凯氏法测定，铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）按照镀铜镉还原-重氮化偶合比色法进行测定，全磷（TP）和速效磷（AVP）采用NaOH熔融-钼锑抗比色法测定[11]。

1.4.2 土壤微生物酶活性测定

多酚氧化酶（PPO）采用邻苯三酚比色法测定，过氧化物酶（PER）采用高锰酸钾滴定法测定，脲酶（Urease）采用苯酚钠比色法[12]测定，β-1, 4-葡萄糖苷酶（BG）、酸性磷酸酶（ACP）、β-1,4-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）和纤维二糖水解酶（CBH）采用96微孔板荧光法测定，各土壤胞外酶的功能见表2[13]。

表2 土壤胞外酶基本信息

1.4.3 烟草农艺性状指标测定

按照《YC/T 142—2010烟草农艺性状调查测量方法》测量株高、自上而下第4片叶叶长和叶宽，再收取所有的烟草，将根、茎和叶分开，用天平称量根鲜重、茎鲜重、叶鲜重、相同叶位单叶鲜重，再将相同叶位叶片洗净，放入烘箱105℃杀青0.5 h，再转65℃烘48 h至恒重，称量其干重。

1.4.4 数据分析

使用Excel 2016对数据进行初步整理，再用SPSS 19.0中单因素方差分析、多因素方差分析、Person相关分析和Ducan's检验在0.05水平上比较不同数据组间差异性，用Canono做冗余分析（RDA），最后用Excel制表，Origin和Adobe illustrator制图。

2 结果

2.1 不同微生物菌剂对不同连作年限土壤理化性质的影响

如表3所示，未添加微生物菌剂土壤pH值、SOC、TN、AVP、NH4+-N和NO3--N含量随着连作年限的增加均呈下降，且均在连作8 a时最低，而TP含量呈先降后增趋势，连作3 a最低，连作8 a最高。

在连作1 a的土壤中添加微生物菌剂A、B和C处理，植烟土壤pH值、AVP和NO3--N含量呈上升，但对SOC、TN、TP和NH4+-N含量影响均不显著。在连作3 a的植烟土壤中添加3种微生物菌剂能提高土壤pH值、SOC、TN、TP、AVP、NH4+-N和NO3--N含量。在连作5 a的植烟土壤中添加微生物菌剂A、B和C能显著提高土壤的SOC、TN、AVP和NO3--N含量，而pH值和TP含量在3种微生物菌剂处理下均无显著变化。在连作8 a的植烟土壤中，微生物菌剂A、B和C的施用能显著提高土壤的pH值、TN、AVP和NO3--N含量，而SOC含量在3种微生物菌剂处理下均无显著变化，微生物菌剂C对NH4+-N含量影响不显著。以上结果表明，微生物菌剂对植烟土壤pH值、SOC、TN、AVP、NH4+-N和NO3--N含量影响显著。

表3 不同微生物菌剂对不同连作年限植烟土壤理化性质的影响

注：小写字母表示不同微生物菌剂对烟草不同连作年限土壤处理之间存在显著差异，<0.05，后同。

Note: Lowercase letters indicate that different microbial agents have different influences on the tobacco soil with different continuous cropping years,<0.05, the same as below.

2.2 不同微生物菌剂对烟草不同连作年限土壤酶活性的影响

未添加微生物菌剂的土壤随连作年限增加，NAG（图1d）活性增加，而PER（图1b）、ACP（图1g）和CBH（图1h）活性降低，同时Urease（图1 a）、PPO（图1c）和BG（图1e）活性均在连作5 a植烟土壤中为最高，LAP（图1f）活性在连作8 a中为最高。

连作1 a的植烟土壤中添加微生物菌剂，土壤PER和BG活性均呈上升趋势，CBH活性为下降；同时PPO、BG、LAP和ACP活性均在施用菌剂C后达到最高。而Urease活性在3种微生物菌剂处理下均无显著变化。在连作5 a的植烟土壤中添加3种微生物菌剂，土壤PER、PPO、BG和ACP酶活性降低，但NAG和LAP酶活性升高，同时Urease活性在菌剂B中达到最高，CBH活性在菌剂C中活性最高。在连作8 a的植烟土壤中添加微生物菌剂，土壤酶PER、BG、LAP和CBH活性均升高，NAG和ACP活性在菌剂C中达到最高，Urease活性在菌剂B中达到最高，而PPO活性在3种微生物菌剂处理下均无显著变化。以上结果表明，微生物菌剂对PPO、BG、NAG、LAP、ACP和CBH活性影响显著。

注：无相同小写字母表示不同微生物菌剂对烟草不同连作年限土壤处理之间存在显著差异，P<0.05，后同。

2.3 不同微生物菌剂对烟草不同连作年限土壤酶的生态化学计量比的影响

如图2所示，未施用菌剂处理下，不同的连作年限之间土壤酶的生态化学计量比差异显著。不同连作年限植烟土壤中施用微生物菌剂处理，显著改变了土壤酶的生态化学计量比。未添加微生物菌剂土壤随着连作年限的增加，(BG+CBH)：(NAG+LAP)（图2a）和(BG+CBH)：ACP（图2b）均呈下降趋势，分别在连作8 a和连作5 a达到最低；(NAG+LAP)：ACP（图2c）在连作8 a达到最高，连作5 a为最低。

连作1 a的植烟土壤中添加微生物菌剂，（BG+ CBH）：（NAG+LAP）在菌剂C处理下降低26.42%，菌剂A和B处理下，其值变化不显著；（BG+CBH）：ACP在菌剂A处理中上升了19.44%，在菌剂C处理中下降了24.29%；（NAG+LAP）：ACP在菌剂A处理中上升了22.40%，菌剂B和C处理之间变化不显著。在连作3 a的植烟土壤中，（BG+CBH）：（NAG+LAP）、（BG+CBH）：ACP和（NAG+LAP）：ACP在3种微生物菌剂的处理下均呈上升趋势。在连作5 a的植烟土壤中，（BG+CBH）：（NAG+LAP）在3种微生物菌剂的处理下均呈下降趋势，（BG+CBH）：ACP在菌剂A中下降，在菌剂B和C中升高，（NAG+LAP）：ACP在3种微生物菌剂的处理下均呈上升趋势。连作8 a的植烟土壤中，（BG+CBH）：ACP和（NAG+LAP）：ACP在3种微生物菌剂的处理下均呈上升趋势，但对（BG+CBH）：（NAG+LAP）无显著变化。

2.4 微生物菌剂对不同连作年限烟草的农艺性状的影响

不同连作年限植烟土壤对烤烟株高、茎鲜重、叶鲜重、根鲜重、相同叶位叶鲜重、相同叶位叶干重、叶长、叶宽和地上部鲜重/地下部鲜重等农艺性状影响极显著；微生物菌剂对除地上部鲜重/地下部鲜重外所有农艺性状影响极显著；两者的交互对叶鲜重、根鲜重、相同叶位叶干重、叶长、叶宽和地上部鲜重/地下部鲜重影响显著，对株高、茎鲜重和相同叶位叶鲜重无显著影响。

如表4所示，未添加微生物菌剂的情况下，烟草的农艺性状指标随连作年限增加均呈下降趋势，且均在连作8 a达最低。在连作1 a、3 a、5 a、8 a的土壤中分别添加微生物菌剂A、B和C，烤烟株高、茎鲜重、叶鲜重、根鲜重、相同叶位叶鲜重、相同叶位叶干重、叶长均为上升，但叶宽在1 a无显著变化，其余连作年份均为上升，地下部/地上部鲜重比在1 a为增加，其余连作年限为降低。

表4 微生物菌剂对不同连作年限烟草农艺性状的影响

2.5 不同连作年限土壤酶活性的冗余分析

如图3所示，分别对连作年限为1 a、3 a、5 a和8 a进行冗余分析（Redundancy analysis，RDA），连作5 a的植烟土壤中（图3C），RDA1和RDA2轴共解释了根际土壤胞外酶活性和根际土壤理化性质变量之间关系的33.70%和12.91%的变异，而22.00%（条件效应）的根际土壤胞外酶活性的变异能够被pH解释（=2.8，=0.038）；连作8 a植烟土壤中（图3D），前两轴RDA1和RDA2共解释了根际土壤胞外酶活性和根际土壤理化性质变量之间关系的33.72%和22.44%的变异，而24.40%（条件效应）的根际土壤胞外酶活性的变异能够被TP解释（=3.2，= 0.01），20.30%（条件效应）的根际土壤胞外酶活性的变异能够被SAP解释（=3.3，=0.002）。

3 讨论

土壤微生物在土壤碳、氮循环中扮演重要角色[14]，在协调植物养分供应与利用方面发挥关键作用[15]。但随连作年限增加，土壤pH值、有机碳、全氮、硝态氮和铵态氮含量均呈下降趋势，且烤烟株高、根鲜重、茎鲜重、叶鲜重、相同叶位叶鲜重、相同叶位叶干重、叶长和叶宽等农艺性状也极显著降低，说明连作导致土壤酸化、碳氮等营养元素降低、影响土壤微生物群落结构，最终影响烟株生长[16]。陈晓燕等[17]研究表明枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的聚谷氨酸复合微生物菌剂能促进土壤有机质分解成腐殖质，改善土壤酶活性，显著提高土壤有机质含量，提高土壤肥力；王鹏等[18]研究也表明枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌能改善云烟87的农艺性状，促进根系生长。本研究表明，3种微生物菌剂均能提高连作土壤pH值、有机碳、全氮、有效磷、硝态氮和铵态氮含量，促进烟草生长，其中恩格兰菌剂和中微所菌剂能显著提高连作1 a植烟土壤有效磷和硝态氮含量；在3 a植烟土壤中，纯微菌剂对总氮、总磷和硝态氮含量影响最大，恩格兰菌剂对铵态氮含量影响最显著，中微所菌剂对pH值、有机碳和有效磷含量影响最大；连作5 a时，B微生物菌剂显著增加了土壤硝态氮含量；连作8 a时，3种微生物菌剂对pH值和全磷含量影响表现最为显著。

土壤酶活性能反映土壤肥力的高低，同时反映土壤有机养分转化情况[19]。长期连作土壤酶活性变化是连作障碍产生的主要原因之一[20]。本研究发现，随连作年限增加，PER、ACP和CBH活性降低，PPO和NAG活性增加，BG活性在连作8 a达到最低，说明连作会影响土壤中养分的循环和转化，引发连作障碍，这与前人对大蒜[21]、蔬菜[22]的结论一致。李伟等[23]认为枯草芽孢杆菌能显著提升苹果园土壤磷酸酶、脲酶、蛋白酶、蔗糖酶活性；刘红杰等[24]研究表明微生物复合肥、摩西球囊霉、幼套球囊霉可提高烤烟连作土壤中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性；李国等[25]研究表明枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌能提升土壤酶活和速效养分质量分数，从而缓解棉花连作障碍。本研究中，3种微生物菌剂均能促进土壤中的碳氮循环，增加土壤中的碳氮含量，促进烟株生长，缓解连作障碍。其中，纯微菌剂和恩格兰菌剂能提高连作1 a植烟土壤的PER和BG活性，中微所菌剂能提高NAG和LAP的活性；连作3 a时，恩格兰菌剂显著地提高PER和BG活性，同时还能改善NAG、LAP和CBH活性；连作8 a时，3种微生物菌剂均能改善PER和BG活性，同时也对LAP和CBH活性影响表现显著。

4 结论

（1）随连作年限增加，土壤pH值、有机质、总氮、铵态氮和硝态氮含量降低；株高、根鲜重、茎鲜重、叶鲜重、相同叶位叶鲜重、相同叶位叶干重、叶长和叶宽降低；PER、ACP和CBH活性降低， PPO和NAG活性增加，BG活性在连作8 a最低。

（2）连作土壤中添加外源有益微生物，能提高土壤有机碳、全氮、有效磷、硝态氮和铵态氮含量，改善土壤pH值和胞外酶活性，促进土壤中碳氮循环，增加土壤中碳氮含量，促进烟草生长，缓解连作障碍。

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Effects of microbial agents on physicochemical and extracellular enzyme activities of tobacco continuous cropping soil

JIANG Yonglei1, XIAO Yu2, DENG Xiaopeng1, XIANG Yansuobao3, DONG Hua3, MA Erdeng1, LI Junying1, CHEN Yi1*

1 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650021, China;2 College of Landscape Architecture and Horticulture, Southwest Forestry University,Kunming 650224, China;3 Yunnan Aromatic Tobacco Co., Ltd, Baoshan 678000, China

The effects of microbial agents on tobacco soil in different continuous cropping years were studied.The effects of microbial agents on physical and chemical properties, extracellular enzyme activities and agronomic characters of tobacco soil with different years of continuous cropping were studied.(1) Without microbial agents, the contents of SOC, TN, AVP, NH+ 4-N and NO- 3-N decreased with the increase of continuous cropping years, and soil pH value decreased from 5.0 to 6.4. The activities of soil extracellular enzyme peroxidase (PER), acid phosphatase (ACP) and fibrinose hydrolase (CBH) decreased in different degrees. At the same time, the plant height, fresh weight of root, stem and leaf organs, dry weight, fresh weight of leaves, leaf length and leaf width all decreased, and reached the lowest levels after continuous cropping for 8 years. (2) After microbial agent treatment, the contents of soil organic carbon, total nitrogen, available phosphorus, nitrate nitrogen and ammonium nitrogen showed an increasing trend, and the soil pH value was in the range of 6.0 to 7.1; The extracellular enzyme activities of soil were improved in different degrees.All the three microbial agents could improve extracellular enzyme activity, carbon and nitrogen cycling ability, increase nutrient content in soil, promote tobacco growth, and alleviate continuous cropping obstacle.

microbial agent; continuous cropping. physicochemical properties; enzyme activity

Corresponding author. Email：229781579@qq.com

云南省科学技术厅基础研究专项（202001AU070006）；云南中烟工业有限责任公司重点项目（2021YL03）；中国烟草总公司云南省公司科技计划重点项目（2019530000241011）

姜永雷（1988—），博士，主要从事烟草调制技术研究，Tel：0871-65100297，Email：jiangyatas@163.com

陈颐（1987—），博士，主要从事烟草调制技术研究，Tel：0871-65100247，Email：229781579@qq.com

2021-11-24；

2022-04-01

姜永雷，肖雨，邓小鹏，等. 微生物菌剂对烟草连作土壤理化性质及土壤胞外酶酶活性的影响[J]. 中国烟草学报，2022，28（4）. JIANG Yonglei, XIAO Yu, DENG Xiaopeng, et al. Effects of microbial agents on physicochemical and extracellular enzyme activities of tobacco continuous cropping soil[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(4). doi:10.16472/j.chinatobacco.2021.239