杞菊地黄口服液质量控制研究

南荣华，张娜，康小凤，贾萌,3，黄艳

1.陕西省食品药品检验研究院，陕西 西安 710065；2.陕西省医疗器械质量检验院，陕西 西咸新区 712046；3.国家药品监督管理局药品微生物检测技术重点实验室，陕西 西安 710065

杞菊地黄口服液由枸杞子、菊花、熟地黄、山茱萸（制）、牡丹皮等加工而成，滋肾养肝，用于肝肾阴亏，晕耳鸣，明畏光，迎风流泪，视物昏花［1］。熟地黄富含地黄素、梓醇等多种微量元素［2］，具有抗氧化，增强免疫力的药理作用［3-4］。山茱萸有补益肝肾，收涩固脱功效，其化学成分具有神经保护、抗氧化等作用［5］。牡丹皮具有抗氧化，抗菌，抗炎作用，其多糖对糖尿病有治疗作用［6-10］。标准初收录于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第十一册［11］，2020 版《中国药典》中列入马钱苷、莫诺苷、丹皮酚含量测定，文献资料对其余成分的含量研究报道较少。此次研究，同步测定6个指标成分含量，为该制剂质量控制提供技术参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Sartorius BP211D 电子分析天平（d=0.01,0.1 mg，赛多利斯公司）；LC-2040C 3D 高效液相色谱仪（岛津，二极管阵列检测器，Empower 色谱工作软件）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器；UV-2550 紫外分光光度计；UPH-11-10T 超纯水机（优普公司）。

1.2 试药

没食子酸（批号：110831-201204，纯度89.9%）；绿原酸（批号：110753-201716，纯度99.3%）；莫诺苷（批号：111998-201703，纯度97.4%）；马钱苷（批号：111640-201707，纯度99.2%）；木犀草苷（批号：111720-201609，纯度94.9%）；丹皮酚（批号：110708-201407，纯度99.9%）均购自中国食品药品检定研究院。杞菊地黄口服液样品为国家评价性抽验所得，阴性对照为自购合格药材按处方工艺制得。乙腈为色谱纯（德国默克），水为超纯水；其余试剂为分析纯（国药化学试剂公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：（安捷伦C18 柱4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A（乙腈）,B（0.1%甲酸溶液）梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：240 nm（没食子酸、莫诺苷、马钱苷、木犀草甘、丹皮酚），328 nm（绿原酸）；进样量：10～25 μL；理论塔板数以马钱苷峰计算应不低于5 000，梯度见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

对照品溶液：取没食子酸、绿原酸、莫诺苷、马钱苷、木犀草苷、丹皮酚6 种对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成浓度各为0.056 57、0.023 34、0.109 17、0.076 07、0.020 78、0.190 21 mg/mL 的对照品溶液。

供试品溶液：精密量取供试品5 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，称定重量，振摇后超声处理（功率500 W，频率40 kHz）15 min，放至室温，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

2.3 专属性试验

吸取“2.2”项下四种溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定。空白溶液无干扰，专属性好，各组分分离完全，见图1。

图1 HPLC色谱图：A.混合对照品（240 nm）；B.混合对照品（328 nm）；C.供试品（240 nm）；D.供试品（328 nm）；E.空白溶液（240 nm）；F.空白溶液（328 nm）

2.4 线性关系考察

精密称取马钱苷对照品7.18 mg、莫诺苷对照品7.75 mg、丹皮酚7.51 mg 置25 mL 量瓶中，再精密加入绿原酸对照品溶液（浓度0.233 4 mg/mL）、木犀草苷对照品溶液（浓度0.207 8 mg/mL）、没食子酸对照品溶液（0.565 7 mg/mL）各5 mL，加入50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，作为线性浓度①。分别精密吸取线性浓度①溶液5.0、3.0、2.0、1.0 mL 置10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性浓度②、③、④、⑤。再取线性浓度⑤溶液，精密吸取5.0 mL 置10 mL 量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，作为线性浓度⑥。分别精密吸取上述六种溶液各10 μL，按拟定方法进行测定，以对照品的进样量（μg）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。回归方程分别为：没食子酸Y=888 642.35X-1 163.13，r=1.000 0；绿原酸Y=2 968 925.52X-8 028.39，r=1.000 0；莫诺 苷Y=1 649 043.91X-241.06，r=1.000 0；马 钱苷Y=1 477 886.09X-5 639.72，r=1.000 0；木犀草苷Y=1 855 045.43X-1 177.50，r=1.000 0；丹皮酚Y=1 250 925.49X+46 760.59，r=1.000 0。结果表明，没食子酸进样量0.056 6～1.131 4 µg、绿原酸进样量0.023 3～0.466 8 µg、莫诺苷进样量0.151 0～3.019 4 µg、马钱苷进样量0.142 5～2.849 0 µg、木犀草苷进样量0.020 8～0.415 6 µg、丹皮酚进样量0.150 0～3.001 0 µg，线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2”项下对照品溶液10 μL，重复进样6 次，按拟定色谱条件测定峰面积。没食子酸、绿原酸、莫诺苷、马钱苷、木犀草苷、丹皮酚峰面积的RSD 值依次为0.17%、0.11%、0.13%、0.11%、0.17%、0.06%，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液10 μL，按拟定色谱条件进样6 次，每次间隔5.5 h，结果表明稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同批号口服液，照拟定方法平行制备供试品溶液6 份，测定峰面积，计算得没食子酸、绿原酸、莫诺苷、马钱苷、木犀草苷和丹皮酚含量的RSD 值分别为0.30%、0.72%、0.42%、0.24%、1.31%、0.65%。

2.8 加样回收试验

精密吸取已知含量的杞菊地黄口服液（没食子酸0.156 6 mg/mL，绿原酸0.010 85 mg/mL，莫诺苷0.364 8 mg/mL，马钱苷0.176 6 mg/mL，木犀草苷0.013 33 mg/mL，丹皮酚0.085 16 mg/mL）6 份，每份2.5 mL，精密加水2.5 mL，精密加入对照品混合溶液（没食子酸0.023 752 mg/mL，绿原酸0.002 343 mg/mL，莫诺苷0.058 869 mg/mL，马钱苷0.025 038 mg/mL，木犀草苷0.002 05 mg/mL，丹皮酚0.012 268 mg/mL）20 mL，同法制备供试品溶液，按拟定色谱条件测定，计算平均回收率，结果见表2（n=6）。

表2 加样回收收率结果

2.9 耐用性试验

更换安捷伦1260 Ⅱ型高效液相色谱仪，资生堂SPOLAR C18 色谱柱，样品待测定峰均分离完全，说明耐用性良好。

2.10 样品含量测定

以拟定方法测定从全国23 个省、自治区、直辖市的不同的抽样地点抽取的7 家不同生产企业样品65 批。结果见表3。

表3 样品含量测定表（mg/mL）

3 讨论

3.1 提取条件

试验建立过程中，参考各方文献，在考察供试品的制备方法时，考虑到六种成分的溶解特性，考察水、50%甲醇、甲醇为溶剂，结果显示，以50%甲醇为溶剂［12］，测定各成分的含量最高；另外考察提取溶剂体积20 mL、50 mL，结果显示20 mL 即可提取完全；考察提取方法及时间，结果超声提取和加热回流提取率差异不大，选择超声提取15 min 便于操作。

3.2 色谱条件

试验考察有机相（甲醇、乙腈），水相（水、0.1%甲酸溶液），梯度洗脱，结果表明，以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相梯度洗脱，基线平稳，分离度较好［13］；考察柱温（25、30、35、40 ℃），为40 ℃时，供试品色谱中目标峰与相邻峰间分离度最佳。

4 结论

此次建立的方法，可以同步测定杞菊地黄口服液中没食子酸、绿原酸、莫诺苷、马钱苷、木犀草苷、丹皮酚六种成分含量，专属性较强，一定程度上同时控制制剂中酒萸肉、牡丹皮、菊花3 味药材的质量，体现不同生产企业、不同批次之间的差异和稳定性［14-15］,评价市售杞菊地黄口服液质量。以性质稳定、特征性强的马钱苷、莫诺苷、丹皮酚为指标成分，为企业质控和药品科学监管提供新的技术参考。