高效液相色谱法测定蒸狗脊中原儿茶酸和原儿茶醛的含量

王然，唐庆，杨德泉，丁野

1.湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南 吉首 416000；2.湖南省药品检验检测研究院，湖南 长沙 410001

狗脊是我国传统药材，有补肝肾、强腰脊、祛风湿的作用，早在《神农本草经》中已有记载，其来源为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz（L.）J.Sm.的干燥根茎［1-2］。狗脊的主要活性成分有糖类、黄酮、皂苷、酚醛等［3-5］，有研究发现其中原儿茶酸、原儿茶醛作为其主要水溶性活性成分，有抗炎、镇痛、活血等作用［6-8］。徐纲等［9］的研究表明原儿茶酸、原儿茶醛对成骨细胞具有一定的促进增殖作用，而在赵敏杰等［10］构建的IL-6、TNF-α 以及IL-11 NO 和PGE2 这一整条炎症形成的信号通路中，烫狗脊的抗炎治疗作用在各环节中均有体现。狗脊饮片规格有净狗脊、烫狗脊、蒸狗脊等，其中蒸狗脊为《湖南省中药饮片炮制规范》2010 年版收载品种［11］，是净狗脊片加酒拌匀，经蒸、闷后干燥而制得的炮制品饮片。蒸狗脊作为新收载的饮片，尚未建立有关原儿茶酸和原儿茶醛含量测定方法，故本文建立一种高效液相色谱法（HPLC）测定蒸狗脊中原儿茶酸和原儿茶醛含量方法，为蒸狗脊饮片的质量控制提供保障。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（检测器：DADG7115A）（安捷伦），色谱柱：YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；AB135-S 型电子天平（梅特勒-托利多）；KQ-200B 超声仪（昆山美美超声仪器有限公司，功率300 W，40 kHz）。

1.2 对照品

原儿茶酸对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号110809-201906，含量以97.7%计）；原儿茶醛对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号：110810-201909，含量以99.6%计）。

1.3 样品和试剂

样品为湖南博世康中医药有限公司及湖南振兴中药有限公司不同批次9 批样品。乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，冰醋酸、磷酸为分析纯。

2 方法建立及方法验证

2.1 色谱条件

液相色谱条件：柱温30 ℃，流速：0.8 mL/min；检测波长为280 nm；进样量为10 µL。流动相：乙腈-1%冰醋酸溶液（3∶97）。对照品溶液制备：分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛对照品，加甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30）（下文统称为甲醇-冰醋酸溶液）制成含原儿茶酸410.34 μg/mL、原儿茶醛241.43 μg/mL 的对照品储备液。分别精密量取原儿茶酸对照品储备液3.0 mL、原儿茶醛对照品储备液2.0 mL，于50 mL 容量瓶中，用甲醇-冰醋酸溶液定容，制成含原儿茶酸24.620 4 μg/mL、原儿茶醛9.657 2 μg/mL 混合对照品液。

供试品溶液制备：准确称取蒸狗脊粉末（过三号筛）1 g 于50 mL 锥形瓶中，加入甲醇-冰醋酸溶液25 mL，称重，冰浴超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-冰醋酸溶液补足减失重量，摇匀后取上清液经0.45 μm 滤膜后，备用。

2.2 方法验证

2.2.1 系统适用性试验取混合对照品溶液、供试品溶液按“2.1”进样，照上诉色谱条件进行系统适用性试验，结果见图1、图2。其中供试品的理论板数，按原儿茶酸计算，为21 886，大于3 000；原儿茶酸与杂质峰的分离度为5.0，原儿茶醛与杂质峰分离度为15.6，均大于1.5；原儿茶酸与原儿茶醛拖尾因子分别为1.00、1.02，在0.95～1.05 范围。

图1 原儿茶酸、原儿茶醛混合对照品HPLC色谱图

图2 蒸狗脊供试品HPLC色谱图

2.2.2 线性关系精密称取原儿茶酸对照品、原儿茶醛对照品适量，用甲醇-冰醋酸溶液溶解稀释成不同浓度的混合对照品溶液，进样测定。配制的浓度见表1。

表1 混合对照品浓度（μg/mL）

以峰面积积分值为纵坐标（y），浓度为横坐标（x），绘制标准曲线。原儿茶酸回归方程为y=18.162x+1.196 2，r=0.999 9；原儿茶醛回归方程为y=50.909x-1.507 1，r=1.000 0；结果表明：原儿茶酸对照品在0.531～53.133 μg/mL、原儿茶醛对照品在0.210～21.036 μg/mL 范围内，线性关系良好。

2.2.3 重复性试验按“2.1”制备同一批号的6 份样品测定，经过计算原儿茶酸RSD=2.65%、原儿茶醛RSD=1.95%，表明方法重复性良好。

2.2.4 加样回收率试验按“2.1”称取过三号筛样品1 g（已测定水分为9.74%；按干燥品计算含量为：原儿茶酸0.015 1%，原儿茶醛0.014 0%），进行80%、100%和120%水平的加样回收实验，即准确加入浓度为205.17 μg/mL 的原儿茶酸和浓度为221.50 μg/mL的原儿茶醛对照溶液适量，结果见表2、表3，表明本方法加样回收率达到药典要求。

表2 原儿茶酸加样回收率试验结果

表3 原儿茶醛加样回收率试验结果

2.2.5 稳定性试验取同一蒸狗脊供试品溶液，在提取后的0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样，结果：原儿茶酸RSD=2.01%，原儿茶醛RSD=0.53%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.6 精密度试验取同一蒸狗脊供试品溶液连续进样6 次，计算原儿茶酸的RSD=2.52%，原儿茶醛的RSD=1.46%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 耐用性试验分别用方法一：液相色谱仪安捷伦1260 Ⅱ，色谱柱YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 µm，编号HS12S05-2546WT，YMC 公司）；方法二：岛津LC-20AT，色谱柱ZORBAX SB-AqC18（250 mm×4.6 mm，5 µm，编号USAG019558，Agilent公司）。平行测定同一批号的3 份样品，结果表明，方法重现性良好。见表4。

表4 不同方法测定的原儿茶酸、原儿茶醛含量（%）

2.3 样品含量测定

取蒸狗脊样品，按“2.1”制备供试品溶液，测定，同时测定供试品水分。按干燥品计算，用外标法计算原儿茶酸和原儿茶醛的百分含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果（%）

3 讨论

3.1 流动相和色谱柱的选择

本研究比较了甲醇-0.1%磷酸溶液（15∶85）、甲醇-0.1%磷酸溶液（10∶90）、乙腈-1%冰醋酸溶液（10∶90）、乙腈-1%冰醋酸溶液（5∶95）、乙腈-1%冰醋酸溶液（3∶97）五种流动相［12］，最后确定乙腈-1%冰醋酸溶液（3∶97）作为流动相，蒸狗脊中原儿茶酸和原儿茶醛与干扰物质有良好的分离。因流动相中水相比例高，故选择耐水型C18 柱。

3.2 流速选择

本研究比较了1.0 mL/min、0.8 mL/min、0.6 mL/min 三种流速，因原儿茶酸峰前后都有杂质峰干扰，如选用1.0 mL/min 和0.6 mL/min 流速，主峰与杂质峰分离度达不到要求，选用0.8 mL/min 则能达到分离要求。

3.3 供试品处理

本研究中样品提取方式采用冰浴超声30 min。由于长时间超声会产生大量能量，导致供试液温度上升、蒸发，对目标物的稳定性也有影响，故超声提取过程中用冰浴可在保障目标物的热稳定性前提下，同时保证提取体积的稳定。并采取超声提取先精密称重，超声提取放冷后再精密称重，用甲醇-冰醋酸溶液补足重量的方式，以减少误差。而在提取溶剂上甲醇-0.1%磷酸溶液（15∶85）、甲醇-0.1%磷酸溶液（10∶90）、甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30）几种提取溶剂，综合考虑提取效率，选择甲醇-冰醋酸溶液作为提取溶剂。

本研究用高效液相色谱法同时测定蒸狗脊中原儿茶酸和原儿茶醛，线性关系、重复性、稳定性、精密度、加样回收率、稳定性均到达标准，方法测定简便、快速，结果准确，为蒸狗脊的质量控制提供了参考依据和保障。