HPLC 法测定妇康乐颗粒中延胡索乙素的含量

易徐航，张钰祺，杨恢检，熊毓，周璇，陈雅静

萍乡市食品药品检验所，江西 萍乡 337000

妇康乐颗粒为萍乡市中医院的医院制剂，由延胡索、泽兰、香附、夏枯草、当归、白花蛇舌草、鱼腥草等7 味中药组成。具有清热解毒，利湿止带之功效，主治盆腔炎（附件炎）所致黄带、下腹痛等。延胡索为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥块茎，具有活血，行气，止痛之功效。常用于胸胁、脘腹疼痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛［1］，其主要药效成分为延胡索乙素［2-6］。研究表明，延胡索乙素具有镇痛、保护心肌等作用［6-10］。处方中延胡索作为其中君药之一，其品质将直接影响到妇康乐颗粒制剂的临床疗效。因此，为更好地对妇康乐颗粒中延胡索进行内在质量的控制，本研究以延胡索乙素作为考察指标，采用HPLC 法建立了妇康乐颗粒中延胡索乙素的含量测定方法，以期为妇康乐颗粒的内在质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 试药

对照品：延胡索乙素（中国食品药品检定研究院，批号：110726-202020，含量以99.3%计）；试剂：甲醇、乙腈（HPLC 级，北京百灵威公司）；其他试剂均为AR 级；水为屈臣氏蒸馏水；妇康乐颗粒（规格10 g/袋）由萍乡市中医院提供。

1.2 仪器

高效液相色谱仪（美国Agilent 公司，型号1200）；万分之一天平（瑞士Mettler 公司，型号ME-204）；十万分之一天平（德国Satorius 公司，型号CP225D）；酸度计（德国Satorius 公司，型号PB-10）；超声仪（江苏昆山舒美公司，型号KQ-500VDE）。

2 方法及结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品储备液的制备精密称取延胡索乙素对照品9.75 mg 置100 mL 量瓶中，加入甲醇-浓氨试液（20∶1）混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL 含0.096 8 mg 的储备溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备取5 袋内容物置研钵中研细，称取约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-浓氨试液（20∶1）混合溶液25 mL，称定重量，超声处理（500 W，45 kHz）30 min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇-浓氨试液（20∶1）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备取泽兰100 g、香附150 g、夏枯草200 g、当归150 g、白花蛇舌草300 g、鱼腥草300 g 加水煎煮二次，第一次2 h，第二次1 h，合并煎煮液，滤过，在60 ℃下浓缩煎液至相对密度约为1.15～1.18，加入乙醇使含醇量约为60%，放置48 h，上清液回收乙醇，得相对密度为1.13～1.17（60 ℃）的清膏，加入适量的辅料（糊精和蔗糖），制成阴性样品颗粒，60 ℃以下干燥，制成1 000 g，按“2.1.2”项下方法操作，制成缺延胡索药材的妇康乐颗粒阴性样品溶液，依法测定，结果表明：阴性样品的HPLC 图谱中，未出现与对照品保留时间一致的色谱峰，见图1。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent 5 TC -C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.6%冰醋酸溶液（三乙胺调整pH值为6.0）为流动相A，乙腈为流动相B。梯度洗脱（0～20 min，57% A；20～22 min，57% A →20% A；22～25 min，20% A →57% A；25～35 min，57% A）。检测流速为1.0 mL/min，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。结果显示，对照品与其他组分的色谱峰分离度良好。对照品、供试品、阴性样品色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图：A.延胡索乙素对照品；B.供试品；C.阴性样品

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察精密量取“2.1.1”对照品储备液，加甲醇-浓氨试液（20∶1）混合溶液逐级稀释得系列标准溶液，含延胡索乙素分别为6.052，12.105，24.209，48.419，96.837 mg/L。按“2.2”项下色谱条件进样，以进样浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，得线性方程：Y=17.961 2X+0.750 4，r=0.999 9。结果表明对照品进样浓度在6.052～96.837 mg/L 范围内呈良好线性关系。

2.3.2 精密度试验精密吸取对照品溶液（24.209 mg/L）10 μL，按“2.2”项下色谱条件连续进样6 针，记录对照品的峰面积，其RSD 为0.8%。结果表明精密度良好。

2.3.3 稳定性实验取同一批次（批号20210412）的样品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、12 h精密吸取10 μL 进样，按“2.2”项下色谱条件，记录峰面积，结果RSD 为0.8%。结果表明在室温下妇康乐颗粒供试品溶液12 h 内稳定。

2.3.4 重复性试验取同一批次（批号20210412）样品6 份，按“2.1.2”项下方法制备重复性试验供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算延胡索乙素的含量（mg/g）。结果RSD 为1.6%，表明该方法重现性良好。

2.3.5 加样回收率试验取已知含量（0.060 2 mg/g）的妇康乐颗粒样品，置研钵中研细，称取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入适量对照储备液，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项下色谱条件测定含量，测定加样回收率，结果表明延胡索乙素的平均回收率为98.7%，RSD 为2.7%，结果见表1。

表1 回收率试验

2.3.6 耐用性试验取同一批次（批号20210412）样品，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项下色谱条件，分别采用Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 种品牌的色谱柱进行测定，结果差异无统计学意义。

2.4 样品测定

取不同批号妇康乐颗粒样品，按“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试液。按“2.2”项下色谱条件进样和分析，结果见表2。

表2 妇康乐颗粒样品中延胡索含量测定结果（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

采用DAD 检测器对延胡索乙素对照品在210～400 nm 波长范围内扫描，结果显示最大吸收波长为280 nm，故选择280 nm 作为检测波长。在流动相的选择中，由于妇康乐颗粒中含七味中药，成分复杂，参考《中国药典》2020 年版一部延胡索含量测定项下流动相0.1%磷酸（三乙胺调整pH 值为6.0）-甲醇（45∶55），结果延胡索乙素的分离度达不到要求。通过对甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸（三乙胺调整pH 值为6.0），0.6%冰醋酸溶液（三乙胺调整pH 值为6.0）-乙腈系统梯度洗脱进行比较，结果0.6%冰醋酸溶液（三乙胺调整pH 值为6.0）-乙腈梯度洗脱条件下分离效果最好，峰形最佳，故选择0.6%冰醋酸溶液（三乙胺调整pH 值为6.0）-乙腈为流动相。

3.2 提取方法及时间的考察

提取条件采用超声提取法分别考察了甲醇、50%甲醇、甲醇-浓氨试液（20∶1）混合溶液作为提取溶剂［11-12］，结果表明甲醇-浓氨（20∶1）提取方式最佳。在此基础上，分别考察了超声和回流2 种提取方式，结果超声与回流提取效率相似，故选用操作简便的超声提取方式。同时对甲醇-浓氨试液（20∶1）混合溶液用量10 mL、25 mL、50 mL 以及超声处理时间15 min、30 min、1 h 进行考察，最后确定采用甲醇-浓氨试液（20∶1）混合溶液25 mL 超声处理（500 W，45 kHz）30 min 为宜。

3.3 小结

本研究建立了妇康乐颗粒中延胡索乙素的含量测定方法，经方法学验证，该方法准确、快速，操作简便，专属性强，重现性好。从5 批妇康乐颗粒样品中延胡索的含量测定结果来看，延胡索乙素的含量为0.055 1 mg/g～0.119 0 mg/g，可用于妇康乐颗粒的质量评价。