气相色谱内标法测定注射级聚山梨酯80 中乙二醇、二甘醇、三甘醇残留量

谢华萍，邓双炳,2，魏勇翔，钟仁清，唐会英，张继辉

1.江西青峰药业有限公司，江西 赣州 341000；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；3.江西省药品检查员中心第三检查所，江西 赣州 341000

现今，随着中药注射剂不断地发展，在临床上广泛应用，关于其不良反应的研究也逐渐增多［1-3］，辅料的质量安全也逐渐成为大家关注的重点，有研究表明［4］，辅料在药品制剂的质量、安全性和有效性方面有重要的影响，也越来越多证据表明，注射剂中辅料造成的不良反应的是很多注射剂不良反应的根源甚至可以引起群体性药害事件［5］，如依托泊苷注射液、多西紫杉醇注射液和鱼腥草注射液等事件［6-7］，均表明聚山梨酯80 是引起不良反应的主要原因之一。因此聚山梨酯80 的质量安全性研究应该进一步加强，残留溶剂是评价质量安全性的重要指标，现今注射剂药用辅料残留溶剂研究的文献［8］非常少。乙二醇、二甘醇及二甘醇，是聚山梨酯80 合成过程中使用了环氧乙烷而形成的副产物，在终产品中很有可能存在，可能具有一定的毒性［9］，存在较大风险。《中国药典》2020 年版［10］方法对三种溶剂进行了研究，但是该方法柱温升温程序较长，故对方法进行探索。本研究参考《中国药典》2020 年版四部通则［10］，建立气相色谱（GC）法同时测定注射用辅料聚山梨酯80 中的乙二醇、二甘醇、三甘醇。

1 仪器和试药

1.1 仪器

7890B 气相色谱仪（安捷伦公司）、XS205 电子天平（梅特勒-托利多有限公司）。

1.2 试药

乙二醇（批号：140812-001，广东光华科技股份有限公司），二甘醇（批号：151208-001），三甘醇（批号：151208-001）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,3-丁二醇（批号：150602-001，上海麦克林生化科技有限公司），无水乙醇（批号：200409-005，美国天地公司）；聚山梨酯80（批号：180301、180302、190502，湖北葛店人福药用辅料有限责任公司）。

1.3 溶液的制备

空白溶液：无水乙醇。内标溶液：取适量1,3-丁二醇，精密称定，用无水乙醇制成每1 mL 含1,3-丁二醇4 mg 的溶液。供试品溶液：精密称定样品聚山梨酯80 约4 g，加入100 mL 量瓶中，再精密移取内标溶液1 mL，加无水乙醇至刻度，混匀。对照品贮备溶液：分别取适量二甘醇、三甘醇和乙二醇，精密称定，用无水乙醇稀释制成每1 mL 含二甘醇、三甘醇和乙二醇各4 mg 的溶液。对照品溶液：精密量取对照品贮备溶液及内标溶液各1 mL，置于100 mL 量瓶中，加无水乙醇至刻度，混匀。灵敏度试验溶液：取对照品溶液1 mL，精密量取，置于10 mL 量瓶中，加无水乙醇至刻度，混匀。

1.4 色谱参数

色谱柱：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷（DB-624，60 m×0.32 mm×1.8 μm）为固定液的毛细管柱。柱温：程序升温，具体参数见表1；载气（N2）流速5 mL/min，分流比为2∶1，进样口温度为230 ℃，检测器温度为250 ℃。

表1 升温程序

1.5 测定法

分别取空白溶液、灵敏度溶液、内标溶液、对照品溶液及供试品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，记录色谱图。

2 方法与结果

2.1 专属性

分别取空白溶液、对照品溶液及供试品溶液按照拟定方法进行测定，结果乙二醇、1,3-丁二醇、二甘醇、三甘醇保留时间分别为6.382 min、11.057 min、12.871 min、18.111 min，各组分的分离度大于2.0，且空白对测定无干扰，专属性良好。见图1。

图1 色谱图：A.空白溶液；B.对照品溶液；C.供试品溶液

2.2 检测限与定量限

照“1.3”项下制备对照品溶液，再用空白溶液稀释成不同浓度，以3 倍基线噪音计算，可以得到乙二醇、二甘醇、三甘醇的检测限；以10 倍基线噪音计算，可以得到乙二醇、二甘醇、三甘醇的定量限，结果表明，此方法的检测灵敏度及定量限均能达到报告限度的要求。见表2。

表2 3种溶剂的检测限及定量限、线性关系

2.3 线性与范围

取“1.3”项下对照品贮备液，用无水乙醇制成每1 mL 溶液中含乙二醇和二甘醇、三甘醇定量限浓度及8 μg、20 μg、40 μg、48 μg、60 μg 浓度的线性溶液，进样测定。

绘制的标准曲线纵坐标为各溶剂的峰面积，横坐标为不同浓度。结果表明，各溶剂相关系数（r）均大于0.999 0，能满足线性要求。见表2。

2.4 精密度

按“1.3”项下制备空白溶液及对照品溶液。加标供试品溶液：精密称定聚山梨酯80 样品6 份，约4 g，置于100 mL 量瓶中，再精密加入内标溶液及对照品贮备液各1 mL，加无水乙醇至刻度，混匀。按照拟定方法进行测定，计算各溶剂测定值RSD（n=6），均不超过10%，方法的重复性符合验证要求；由不同人员、不同日期，同重复性试验的方法进行中间精密度测定，将结果与重复性试验测定的结果计算各溶剂测定值的RSD（n=12），均不超过10%，方法的中间精密度符合验证要求。表明方法的精密度良好。见表2。

2.5 准确度

按“1.3”项下制备空白溶液及对照品溶液。加标供试品溶液：精密称定聚山梨酯80 样品9 份，约4 g，置于100 mL 量瓶中，精密移取1 mL 内标溶液，再精密移取0.8 mL、1 mL、1.2 mL 对照品贮备液（由于目标成分为未检出或者含量较低，故统一按照限度浓度进行加标，加标浓度分别为限度浓度的80%、100%、120%），每个浓度水平各三份，再加无水乙醇至刻度，混匀。分别按照拟定方法进行测定，并计算各溶剂的回收率和RSD。各溶剂回收率范围为80%～120%，且RSD 小于10%，表明准确度良好。分别见表3～5。

表3 乙二醇回收率试验结果

表4 二甘醇回收率试验结果

表5 三甘醇回收率试验结果

2.6 耐用性

2.6.1 溶液稳定性在自然条件下，取“2.4”项下加标供试品溶液，分别于0、4、8、24 h 进样，计算结果为RSD 为0.2%～8.2%，说明自然条件下的供试品溶液24 h 内稳定。

2.6.2 色谱参数变化取“1.3”项下的对照品溶液和“2.4”项下加标供试品溶液，分别按正常参数和调整流速、柱温等参数条件下进样，以各溶剂含量为测定值。计算参数变化后的测定值和正常参数测定值的RSD。结果显示，流速的变化范围为4.5 mL～5.5 mL，各溶剂的RSD 不大于3.5%；柱温的变化范围为55 ℃～65 ℃，各溶剂的RSD 不大于2.8%。均不大于10%，方法耐用性良好。

2.7 样品结果

取3 批聚山梨酯80 样品按拟定方法测试，结果见表6。

表6 样品测试结果表（%）

3 讨论

本研究主要建立了注射级药用辅料聚山梨酯80中乙二醇、二甘醇、三甘醇残留溶剂检测方法并进行方法学验证，结果表明方法专属性强、重复性好、准确度高、操作简便。本研究对中国药典方法进行优化，缩短了检测分析时间，节约时间及成本，可为聚山梨酯80 的残留溶剂控制提供一种替代方案；也为其他注射级药用辅料的残留溶剂分析方法提供参考，具有一定的指导意义。