鞣花酸通过转化生长因子-β/丝/苏氨酸激酶受体通路对心肌梗死大鼠心肌纤维化的改善作用

邹琳，张昕，李丽

心肌梗死后左心室重构是心力衰竭（心衰）的结构基础，是左心室大小、形状、功能、细胞和分子组成等复杂的短期和长期病理生理变化，这一进程主要依赖于炎症反应和心肌纤维化[1]。心肌纤维化是受损的正常心肌组织被纤维化组织替代，丧失其正常的结构、功能的病理性进程，与胶原蛋白等心肌细胞外基质的过度沉积有关，是独立于射血分数之外的心衰患者死亡的重要因素之一。心肌纤维化的发生发展由多种细胞因子介导的多条信号通路参与，其中转化生长因子（TGF）-β/丝/苏氨酸激酶受体（Smad）通路是启动心肌纤维化的核心通路[2]。通过抑制TGF-β/Smad 通路改善心肌纤维化水平，对治疗心肌梗死后纤维化具有重要的研究及临床意义。

鞣花酸是一种分子量为302.28 的多酚类化合物，其分子式为C14H6O8，广泛存在于石榴等浆果与各类干果中，具有抗炎、抗氧化与抗癌作用。有研究表明，鞣花酸可通过抑制Wingless/Integrated（Wnt）信号通路减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化[3]。同时研究表明，鞣花酸可通过调节TGF-β/Smad 通路诱导人结直肠腺癌细胞（HCT-116）周期阻滞和凋亡[4]。此外鞣花酸还被证实为传统蒙药冠心舒通胶囊的有效成分之一[5]，而冠心舒通胶囊的抗心肌纤维化作用与其拮抗TGF-β/Smad 通路有关[6]。因此推测鞣花酸也可通过调节TGF-β/Smad 通路改善心肌梗死大鼠心肌纤维化。本实验拟采用开胸结扎冠状动脉左前降支建立大鼠心肌梗死模型，观察鞣花酸是否可通过抑制TGF-β/Smad 通路减轻心肌纤维化程度，改善心脏功能。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：80 只SD 雄性大鼠，SPF 级，体质量均为200～220 g，购于内蒙古大学实验动物研究中心，动物许可证号：SCXK（蒙）2016-0001。适应性喂养1 周后开始实验。

主要药物及试剂：鞣花酸（纯度≥98%，货号：E808704，购自上海麦克林生化科技有限公司）；吡非尼酮（购自北京康蒂尼药业有限公司）；白细胞介素（IL）-6（货号：CK-E30219）、Ⅰ型胶原蛋白α2（COL1α2，货号：CK-E31131）、Ⅲ型胶原蛋白α1（COL3α1，货号：CK-E37320）、酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自上海机纯实业有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒（货号：PICPI23223，购自美国Thermo Fisher Scientific 公司）；蛋白预染Marker（货号：SM1811，购自美国Fermentas 公司）；TGF-β1（货号：Ab215715）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，货号：Ab9485）抗体均购自美国 Abcam 公司；Smad2（货号：#5339）、Smad3（货号：#9523）抗体均购自美国CST 公司；引物由上海信帆生物科技有限公司合成；SYBR Green PCR 试剂盒（货号：#K0223，购自美国Thermo Fisher Scientific公司）；逆转录试剂盒（货号：#K1622，购自美国Fermentas 公司）。

仪器：mini protean 3 cell 型电泳仪（购自美国BIO-RAD 公司）；TE77XP 型电转仪（购自美国HOEFER 公司）；MK3 型酶标仪（购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；Vivid E9 型心动超声仪器（购自美国 GE 公司）；Real-time 检测仪（购自美国ABI公司）。

1.2 分组、建模及给药

通过结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型。取雄性SD 大鼠80 只，按随机数表法挑选20 只作为假手术组，其余60 只建模。大鼠术前禁食水12 h，腹腔内注射10%水合氯醛（注射剂量0.4g/kg）。麻醉后固定于手术台上，连接心电图仪器，备皮、消毒、经喉气管插管，连接小动物呼吸机，调整呼吸机数值。开胸，于左心耳和肺动脉圆锥间用6 号手术线结扎冠状动脉左前降支，假手术组仅穿线不结扎。当结扎完大鼠体表心电图Ⅱ导联 ST段抬高≥0.1 mV 即表示冠状动脉结扎成功。抽出大鼠胸腔内气体，用3 号线缝合肋间隙等组织层，术后腹腔注射青霉素5 万U/d 预防感染。建模后假手术组全部存活，其余60 只建模后存活47 只，13 只均于结扎后24 h 内死亡。各组大鼠术后正常给予食水，成模大鼠按随机数表法分为3 组：心肌梗死模型组（n=15）、吡非尼酮组（n=16）、鞣花酸组（n=16）。称取300 mg 吡非尼酮和20 mg 鞣花酸，融入5 ml超纯水中，造模4 d 后吡非尼酮组按照300 mg/kg 吡非尼酮，鞣花酸组按照20 mg/kg 鞣花酸，灌胃给药，每日1 次，其余两组给予等量超纯水灌胃，共4 周。

1.3 大鼠心脏多普勒超声检测

大鼠末次给药12 h 后，10%水合氯醛0.4g/kg腹腔注射麻醉。麻醉后固定、备皮，采用心脏多普勒超声检测大鼠左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（FS）。每只大鼠测8个心动周期，取平均值。操作和分析由心功能科专科医师完成。

1.4 大鼠心肌组织处理

处死大鼠，剪下心脏，生理盐水灌洗心腔，洗净心腔内残余血液，将结扎处以下心室壁从心底到心尖切为三等份，分别用于ELISA、蛋白免疫印迹（Western blot）、实时荧光定量PCR（qPCR）检测。将处理好的心肌组织置于-80℃保存。

1.5 ELISA 检测IL-6、COL1α2、COL3α1

取一部分冻存的心肌组织移入玻璃匀浆器，每1 g 心肌组织加入 5 ml（pH=7.4，浓度为10 mM）的磷酸缓冲盐溶液（PBS），置于冰上充分研磨，匀浆液5000 rpm/min，离心5 min，收集上清液。参考文献[7]步骤，使用ELISA 试剂盒检测大鼠心肌组织中IL-6、COL1α2、COL3α1 水平。每组取10 个样本进行实验。

1.6 Western blot 法检测心肌组织中TGF-β、Smad2、Smad3 蛋白水平

取-80℃保存的心肌组织，置于冰上研磨，加入裂解液。裂解后的样品4℃ 12 000 rpm/min，离心15 min，取上清进行BCA 蛋白定量。根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴10 min后离心取上清上样。10%十二烷基硫酸钠（SDS）-多聚酰胺凝胶电泳分离，半干式转膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入特异性一抗TGF-β1、Smad2、Smad3（稀释倍数均为1:1000），和膜室温孵育2 h；孵育一抗的膜用TBST 缓冲液洗涤3 次，每次5min，随后1:1000 稀释HRP 标记的二抗，与膜37℃孵育1 h，用TBST 洗涤3 次，每次5 min。条带用发光液发光，照片用Gel-Pro Analyzer 4.0 软件分析。每组取4 个样本进行实验。

1.7 qPCR 法检测心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表达水平

取适量大鼠心肌组织，提取组织总RNA。将提取的总RNA 按反转录试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA，进行PCR 实验。按照试剂盒说明书进行实验，采集荧光信号40 个循环。目的基因TGF-β1正向引物5' GGACTACTACGCCAAAGAAG 3'，反向引物5' TGTTGCTCCACAGTTGAC 3'；目的基因Smad 2 正向引物5' TCCATCTTGCCATTCACTC 3'，反向引物 5' TCCTGTCCATTCTGTTCTC 3'；目的基因Smad 3正向引物5' TTCACCCTGGGATGTAAG 3'，反向引物5' GGCTCCTCATTTCACAAC 3'；内 参GAPDH 正 向引物 5' GTCGGTGTGAACGGATTTG 3'，反向引物 5'TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3'。目的基因的相对表达水平用2-△△CT表示。每组取3 个样本进行实验。

1.8 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示；多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间比较采用独立样本t检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠心脏彩色多普勒超声检测结果（表1）

表1 四组大鼠心脏彩色多普勒超声检测结果（）

表1 四组大鼠心脏彩色多普勒超声检测结果（）

注：LVEDD：左心室舒张末期内径；LVESD：左心室收缩末期内径；LVEF：左心室射血分数；FS：左心室短轴缩短率。与假手术组比较*P＜0.05，与心肌梗死模型组比较△P＜0.05

与假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠LVEDD、LVESD 均显著增大（P均＜0.05），LVEF、FS 均显著降低（P均＜0.05）。与心肌梗死模型组相比，吡非尼酮组和鞣花酸组大鼠的LVEDD、LVESD均显著缩小（P均＜0.05），LVEF、FS 均显著升高（P均＜0.05）。鞣花酸组与吡非尼酮组的LVEDD（P=0.636）、LVESD（P=0.917）、LVEF（P=0.872）、FS（P=0.710）差异均无统计学意义。

2.2 四组大鼠ELISA 检测结果（表2）

表2 ELISA 法检测四组大鼠心肌组织IL-6、COL1α2、COL3α1 水平（，n=10）

表2 ELISA 法检测四组大鼠心肌组织IL-6、COL1α2、COL3α1 水平（，n=10）

注：ELISA：酶联免疫吸附试验；IL-6：白细胞介素-6，COL1α2：Ⅰ型胶原蛋白α2；COL3α1：Ⅲ型胶原蛋白α1。与假手术组比较 *P＜0.05，与心肌梗死模型组比较△P＜0.05

与假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠心肌组织IL-6、COL1α2、COL3α1 水平均明显降低（P均＜0.05）。与心肌梗死模型组相比，吡非尼酮组和鞣花酸组大鼠心肌组织IL-6、COL1α2、COL3α1 水平均明显升高（P均＜0.05）。鞣花酸组与吡非尼酮组的大鼠心肌组织IL-6（P=0.482）、COL1α2（P=0.994）、COL3α1（P=0.814）水平差异均无统计学意义。

2.3 四组大鼠qPCR 检测结果（图1）

图1 实时荧光定量PCR 检测四组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表达水平

分析四组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表达情况，得到TGF-β1（F=127.124）、Smad2（F=284.247）、Smad3（F=103.582），差异有统计学意义。与假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 水平均明显升高（P均＜0.05）。与心肌梗死模型组相比，吡非尼酮组和鞣花酸组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 水平均明显降低（P均＜0.05）。鞣花酸组与吡非尼酮组的大鼠心肌组织中TGF-β1（P=0.132）、Smad2（P=0.077）、Smad3（P=0.769）mRNA 水平差异均无统计学意义。

2.4 Western blot 检测结果（图2）

图2 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测四组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平（n=4）

分析各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平情况，得到TGF-β1（F=107.624）、Smad2（F=353.296）、Smad3（F=74.287），差异有统计学意义。与假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平

均明显升高（P均＜0.05）。与心肌梗死模型组相比，吡非尼酮组和鞣花酸组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平均明显降低（P均＜0.05）。鞣花酸组与吡非尼酮组的大鼠心肌组织中TGF-β1（P=0.094）、Smad2（P=0.646）、Smad3（P=0.084）蛋白水平差异均无统计学意义。

3 讨论

鞣花酸是一种广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的多酚二内酯，是没食子酸的二聚衍生物。大量研究表明，鞣花酸具有抑制炎性反应、抑制氧化应激的作用[8-9]。此外研究表明[10]，鞣花酸可以抑制糖尿病大鼠心肌纤维化与心室重构，改善其心脏功能。本研究通过结扎大鼠冠状动脉制备心肌梗死模型，以探讨鞣花酸改善心肌纤维化的作用与机制。

结扎大鼠冠状动脉左前降支可模拟临床急性心肌梗死患者的病理生理进程，引起左心室心肌细胞凋亡及瘢痕形成，在心肌梗死早期即表现为心脏收缩与舒张功能障碍，通过多个细胞通路激活心室重塑进程，被广泛应用于建立心肌纤维化的模型。本研究通过心脏多普勒超声检测大鼠心脏功能，结果显示结扎冠状动脉左前降支后，大鼠左心室腔扩大，LVEF 和FS 明显降低。与心肌梗死模型组相比，鞣花酸组大鼠左心室腔明显缩小，LVEF 和FS明显升高。提示应用鞣花酸可改善心肌梗死大鼠的心脏功能。

心肌纤维化是应激、损伤或老化等多种因素引起心脏瘢痕形成的生理病理进程，其特征是心脏成纤维细胞的异常增殖活化，在心肌中沉积过量的胶原基质。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白（Col1、Col3）是参与心肌纤维化主要细胞外基质蛋白。在生理状态下，心肌成纤维细胞不断合成细胞外基质，使其分泌与分解处于动态平衡状态，以维持正常的心脏环境。当心肌梗死发生后，心脏成纤维细胞异常增殖活化以抵抗心肌细胞凋亡，并使胶原纤维大量分泌，合成大于分解，形成心肌纤维化[11]。本研究ELISA 结果提示，与假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠心肌组织中COL1α2、COL3α1 水平明显增高；与心肌梗死模型组相比较，鞣花酸组大鼠心肌组织中COL1α2、COL3α1 水平明显降低。提示应用鞣花酸可以减轻心肌梗死后的心肌纤维化进程。

IL 是重要的炎性细胞因子，在心肌纤维化的进程中扮演重要角色。有研究表明，敲除IL-6 基因可明显降低心肌病小鼠的心肌纤维化程度[12]。本研究ELISA 结果显示，与假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠血清中IL-6 水平明显增高；与心肌梗死模型组相比较，鞣花酸组大鼠血清中IL-6 水平明显降低。提示鞣花酸减轻心肌梗死后心肌纤维化进程与其抗炎作用有关。

TGF-β/Smad 通路是调控心肌纤维化进程的关键性信号通路。TGF-β/Smad 信号通路参与心室重构与炎症、心肌细胞凋亡、心肌肥厚、心肌纤维化等多种进程有关[13]。研究表明，敲除心肌成纤维细胞TGF-β 受体1/2 可以抑制心肌纤维化进程[14]。此外，敲除Smad3 也可以抑制糖尿病心肌病小鼠心肌纤维化进程，同时减轻其心肌病理性肥厚和炎症反应[15]。另外TGF-β1 与Smad3 蛋白水平的下调可减轻慢性心衰兔模型的心肌纤维化程度，减少心肌细胞的凋亡[16]。本研究Western blot 和qPCR 实验结果表明，与假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白和mRNA 表达均明显升高；与心肌梗死模型组相比较，鞣花酸组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白和mRNA 表达均明显降低。提示鞣花酸改善心肌纤维化与抑制TGF-β/Smad 信号通路相关。

吡非尼酮可以降低TGF-βmRNA 水平，抑制TGF-β 蛋白的分泌，是经典的TGF-β/Smad 信号通路抑制剂[17]。一项临床实验表明，吡非尼酮可改善心衰患者的心肌纤维化[18]。本实验ELISA 结果显示，与心肌梗死模型组相比，吡非尼酮组大鼠心肌组织中COL1α2、COL3α1、IL-6 水平均明显降低，与鞣花酸组相比，吡非尼酮组大鼠心肌组织中COL1α2、COL3α1、IL-6 水平无明显差异。本实验Western blot 和qPCR 实验结果表明，与心肌梗死模型组相比，吡非尼酮组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白和mRNA 表达均明显降低；鞣花酸组与吡非尼酮组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白和mRNA 表达均无明显差异。提示TGF-β/Smad 信号通路参与了心肌梗死后心肌纤维化进程，且在本实验剂量下鞣花酸与吡非尼酮在调控TGF-β/Smad 信号通路，改善心脏功能，抑制心肌纤维化的作用无明显差异。

鞣花酸是多个中药有效成分之一，在安全性上有其独特的优势，现阶段常作为药品、保健食品的添加成分。综上所述，鞣花酸可通过抑制TGF-β/Smad 信号通路，减轻炎症反应，改善心肌纤维化治疗心肌梗死，改善心脏功能。为鞣花酸在临床上的应用提出了一定的理论依据与研究方向。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突