植物活性成分抗念珠菌作用机制研究进展

解雨飞 周培茹 华红 刘晓松

(北京大学口腔医学院·口腔医院口腔黏膜科，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室，北京 100081)

念珠菌感染是临床最常见的机会性真菌感染之一，好发于老年人群、癌症化疗、移植术后、HIV感染等免疫低下人群。研究显示，患有恶性肿瘤及接受过手术的老年患者中，侵袭性念珠菌病的患病率分别可达73.7%及74.1%[1]。而HIV感染患者中口咽念珠菌病的患病率可高达79.4%[2]。此外，随着体内置管及心脏瓣膜等植入性生物材料的广泛应用，由生物膜引起的深部真菌感染发病率也日趋增多，并可导致40%～60%的高死亡率[3]。

由于唑类、多烯类、棘白菌素类等传统抗真菌剂的广泛使用、天然耐药性念珠菌株的出现以及非白念珠菌感染比例增加，临床念珠菌耐药现象日渐严重。研究显示，热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌的临床氟康唑耐药率分别可达11.6%、11.9%及13%[4-5]。此外，临床常用传统抗真菌剂还具有肝肾毒性等较为严重的不良反应。FAERS药物警戒数据库显示，药物性肝损伤病例中有2.9%与使用抗真菌剂有关，而酮康唑使用者中发生肝衰竭的比值比可高达4.22[6]。因此，研发新型抗念珠菌剂是临床亟待解决的问题。

植物活性成分是指从植物组织中提取出的化学结构明确的生物活性分子及其衍生物，可分为生物碱类、黄酮类、苯丙烷类、萜类、醌类、有机酸等[7-8]。近年来研究显示：植物活性成分对多种念珠菌具有显著抑制作用，且具有来源广泛、不良反应小、适合长期或预防性使用等多方面优势，成为新型抗真菌剂的重要来源，有待未来在临床应用中发挥重要作用。国内外已有体外研究表明，小檗碱[9]、厚朴酚[10]、丁香酚[11]、土荆皮乙酸[12]等多种植物活性成分可对白念珠菌敏感株、耐药株及非白念珠菌均有较好的抑制作用。此外，大蒜素[13]、百里香酚[14]、网脊衣酸B[15]等多种植物活性成分与传统抗真菌剂联合应用时，还可起到协同增效的作用。本文对近年来(2009—2020年)植物活性成分抗念珠菌研究的作用及机制进行综述，以期为抗念珠菌临床治疗及新药研发提供理论基础和新策略、新思路。

1 植物活性成分抑制念珠菌毒力因子

念珠菌毒力因子包括黏附与侵袭、酵母态—菌丝态形态转换、生物膜形成、水解酶合成与分泌等。念珠菌在宿主体内发挥致病性作用，均有赖于这些毒力因子的参与。

1.1 抑制黏附与侵袭作用

白念珠菌的黏附是其发挥侵袭作用及形成生物膜的关键性第一步，植物活性成分抗念珠菌黏附作用可主要通过细胞实验进行证实。即通过将念珠菌与口腔黏膜上皮细胞共培养，观察在植物活性成分作用下，念珠菌在口腔黏膜上皮细胞表面的黏附情况。马妍等[16]研究发现，400 μg/mL丹皮酚和1 μg/mL氟康唑单独应用时，白念珠菌对人口腔黏膜上皮细胞的黏附率分别为(93.33±4.84)%与(91.67±3.45)%，而联合应用时其黏附率仅为(38.33±1.51)%，因此丹皮酚可与氟康唑协同抑制白念珠菌对人口腔黏膜上皮细胞的黏附。此外，谭心等[17]研究表明，肉桂醛、小檗碱单独使用及其与氟康唑联用时，既可抑制白念珠菌芽管形成，还可显著抑制其对人口腔黏膜上皮细胞的黏附。其机制可能为肉桂醛、小檗碱与氟康唑协同干扰了白念珠菌芽管胞壁蛋白的合成及其相关基因的调控，从而抑制了白念珠菌芽管的形成，并降低了其对宿主细胞的黏附能力。

而在评估植物活性成分抗念珠菌的侵袭作用时，除常规通过PCR检测侵袭素Als3p和Ssalp基因的表达，也可通过细胞实验进行研究。Chang等[15]通过选取人克隆结直肠腺癌细胞系(Caco-2)与白念珠菌共培养，并采用细胞膜探针(DiI)染色法，评估了网脊衣酸B对白念珠菌侵袭宿主细胞能力的影响。其研究结果表明，网脊衣酸B与氟康唑单独应用时，细胞内菌丝侵袭率分别为(68±34)%及(57±16)%，而当两种药物联用后，细胞内菌丝侵袭率可显著减少至(25±16)%，因此证实了植物活性成分的抗念珠菌侵袭作用。

1.2 抑制酵母态—菌丝态形态转换

酵母态—菌丝态形态转换是白念珠菌发挥致病性的基础。白念珠菌可通过由酵母态转化为菌丝态，对宿主细胞产生黏附、穿刺和侵袭作用，进而发挥其致病性。涉及到的相关信号通路主要包括：cAMP/PKA信号通路、MAPK信号通路、Rim101介导的pH信号通路、及Tup1介导的负调通路等[18]。Zhong等[19]研究显示，当血根碱浓度为0.8 μg/mL时，Spider培养基中的白念珠菌全部保持酵母态，未见菌丝生成；而当血根碱浓度达1.6 μg/mL时，白念珠菌cAMP信号通路相关基因ALS3、HWP1、ECE1、HGC1、CYR1的表达水平均显著下调。Sun等[20]研究发现，4 μg/mL的厚朴酚与和厚朴酚可显著抑制白念珠菌菌丝形成，当其浓度达到16 μg/mL时，Spider培养基中的白念珠菌未见菌丝生成，其可能机制为厚朴酚与和厚朴酚抑制了Ras1-cAMP-Efg1信号通路相关基因RAS1、EFG1、TEC1和CDC35的表达。

此外，群体感应分子也与念珠菌的致病性有着十分密切的关联。群体感应分子法尼醇可通过抑制腺苷酸环化酶活性，作用于Ras1-Cyr1-cAMP-Efg1信号通路，进而抑制念珠菌酵母态—菌丝态形态转换及生物膜形成；而酪醇则可以促进其菌丝及生物膜形成[21]。严圆圆等[22]研究发现，穿心莲内酯可影响白念珠菌群体感应分子法尼醇与酪醇的分泌量，并且对法尼醇呈负调作用，对酪醇呈正调作用，且该成分可使群体感应分子编码基因CHK1和PBS2明显下调，最终对白念珠菌酵母态—菌丝态形态转换及生物膜形成产生显著抑制作用。

1.3 抑制生物膜形成

念珠菌生物膜的形成过程可大致分为4个阶段：宿主表面黏附；念珠菌细胞的增殖；菌丝形成及细胞外基质的产生；生物膜成熟后菌体的扩散及其他部位的定植[23]。现有研究显示：植物活性成分的抗念珠菌作用机制包括抑制念珠菌生物膜形成过程、破坏念珠菌生物膜空间结构、影响念珠菌生物膜细胞扩散等。Xie等[9]研究发现，小檗碱对白念珠菌、克柔念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌生物膜的初始形成期至成熟期(6 h、12 h、24 h、48 h)均有抑制作用，其对上述五种念珠菌的最低起效浓度分别为40 μg/mL、40 μg/mL、1280 μg/mL及320 μg/mL，且对48 h生物膜抑制作用最强。激光共聚焦显微镜及3D重建后发现，小檗碱可显著破坏生物膜的空间结构，使细胞排列松散，密度降低，生物膜厚度变薄 [减少率为(15.49±8.45)%～(30.30 ± 15.48)%]。此外，施高翔等[24]研究发现，穿心莲内酯可导致念珠菌生物膜促分散基因HSP90表达上调和抗分散基因UME6表达下调，并在250、500、1 000 mg/L浓度时呈剂量依赖性诱导白念珠菌生物膜播散。该特性可使生物膜中的白念珠菌分散为浮游菌，有利于抗真菌剂将其进一步杀灭。

1.4 抑制水解酶合成与分泌

白念珠菌毒力相关水解酶主要包括分泌性天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartylproteinase, Sap)、磷脂酶(phospholipase, PL)和脂肪酶(lipase, Lip)等。水解酶可介导白念珠菌黏附、侵袭宿主细胞，同时还可裂解宿主免疫应答相关分子，协助白念珠菌逃避宿主的免疫防御机制[25]。多种植物活性成分可通过下调水解酶相关编码基因，抑制水解酶合成，进而减少其分泌。王杨等[26]研究发现紫草素可呈浓度依赖性抑制白念珠菌磷脂酶分泌，8 μg/mL的紫草素可使PLB1和PLB2基因的相对表达量降低56.4%和61.4%，且16 μg/mL的紫草素可使白念珠菌磷脂酶分泌量下降56.3%。许颖等[27]研究发现，当鱼腥草素钠浓度达240 mg/L时，可显著抑制磷脂酶编码基因PLB1和PLB2的表达。与此相反，一些植物活性成分还可通过上调水解酶相关基因表达而发挥作用。王梅竹等[28]研究发现，松油烯-4-醇可抑制浮游态白念珠菌生长(MIC = 2.048 g/L)，但在其作用12 h后，白念珠菌PLB1和SAP2基因表达量均高于对照组。作者推测松油烯-4-醇可能阻止了白念珠菌水解酶PLB、Sap的进一步分泌，使其蓄积于念珠菌体内，进而发挥其抑菌作用，但具体机制还有待在后续研究中确证。

2 植物活性成分诱导念珠菌细胞凋亡

2.1 植物活性成分通过内源性活性氧诱导念珠菌凋亡

环境压力可诱导念珠菌产生并积累大量内源性活性氧(reactive oxygen species, ROS)，导致胞内发生进行性氧化损伤，破坏DNA、蛋白质、脂质等成分[29]。植物活性成分亦可通过诱导念珠菌产生内源性ROS，损伤其细胞器及细胞膜完整性，进而诱导念珠菌发生凋亡。姜璐璐等[30]研究发现：16 μg/mL的和厚朴酚作用2 h或4 h时，白念珠菌胞内ROS含量可显著增加。而32 μg/mL的和厚朴酚作用4 h后，白念珠菌胞内荧光强度可增加至741%。因此在低剂量时，厚朴酚即可诱导白念珠菌迅速产生大量ROS，促进其胞内氧化应激反应，从而诱导白念珠菌凋亡。此外，Choi等[31]研究表明，5 μg/mL番茄红素作用4 h后，白念珠菌胞内罗丹明-123染色荧光强度和HPF染色荧光强度分别增加30.13%和10.01%。因此，番茄红素可通过诱导白念珠菌胞内ROS积累，特别是·OH的积累，从而诱导白念珠菌凋亡。

2.2 植物活性成分通过Caspase信号通路诱导念珠菌凋亡

植物活性成分可通过激活Caspase依赖性信号通路，导致线粒体膜通透性发生改变，进而诱导念珠菌细胞凋亡。胡丹丹等[32]研究发现，4 μg/mL和8～16 μg/mL的紫檀茋可分别诱导14%及17%的白念珠菌发生凋亡。紫檀茋作用3 h后，白念珠菌Caspase酶活性升高，线粒体膜通透性改变，膜电位降低，细胞内ROS积累亦增多，协同诱导了细胞凋亡。此外，冯鑫等[33]研究发现，100 μmol/L和1 000 μmol/L的黄芩苷可诱导白念珠菌细胞核固缩与碎裂，并降低线粒体膜电位，进而导致念珠菌细胞凋亡。

3 植物活性成分抑制念珠菌药物靶酶与外排泵表达

药物靶酶与药物主动外排泵的高表达，是念珠菌耐药的重要机制。药物靶酶相关编码基因主要有ERG5、ERG11。念珠菌耐药相关主动外排泵包括ATP结合盒转运蛋白家族(ATP-binding cassette transporters, ABCT)和主要易化超家族(major facilitator superfamily, MFS)，其相关编码基因分别包括CDR1、CDR2、MDR1、MDR2及FLU1等[34]。曹园等[35]研究表明，当白念珠菌长期暴露于氟康唑后，其ERG5、ERG11、CDR1、CDR2、MDR1与FLU1基因表达均上调，进而诱发其耐药。但当与卷柏素联用后，其可显著逆转上述基因表达水平，使其分别下调86%、71%、62%、67%、56%和36%。另外，董怀怀等[36]研究表明，芒果苷与氟康唑联用时，白念珠菌耐药株CDR1下调最为明显，CDR2、MDR2较氟康唑单用组亦显著下调。Xu等[37]及Shao等[38]研究还发现，当小檗碱与氟康唑联用时，其可对氟康唑耐药型白念珠菌和热带念珠菌有良好的抑菌效果。其机制可能与促进念珠菌胞内额ROS的积累、抑制细胞膜麦角固醇生物合成、及抑制外排泵编码基因CDR1、CDR2、MDR1的表达等有关。

4 小结与展望

现有研究表明，植物活性成分可通过抑制念珠菌毒力因子、诱导念珠菌细胞凋亡、抑制药物靶酶与外排泵基因表达等相关机制发挥其抗念珠菌作用。近年来，植物活性成分在抗念珠菌研究领域的深度、广度不断拓展，显示出良好的应用前景。但目前其研究仍存在一定的不足之处，如研究菌株的数量、种类不足；对非白念珠菌、混合念珠菌感染相关研究缺乏；细胞毒性实验、体内研究及临床研究涉及尚少等。因此，植物活性成分抗念珠菌的有效性及安全性仍有待于进一步明确，未来尚需大量深入的机制研究、体内、外研究以及规范的临床研究等，以进一步确证其疗效及安全性。