白念珠菌耐药机制研究进展

刘佳存 王瑞娜 吕权真 阎澜

(海军军医大学药学系军特药研究中心，上海 200433)

目前常用的抗真菌药包括唑类、棘白菌素类、多烯类以及嘧啶类似物等，但由于抗真菌药物的长期使用以及白念珠菌自身较强的环境适应能力，白念珠菌的耐药问题使临床治疗面临着严峻的挑战[1]。本文就白念珠菌耐药机制研究进展进行综述。

1 药物靶点突变或上调

1.1 唑类药物靶点

唑类药物以白念珠菌ERG11编码的羊毛甾醇14α去甲基酶(Erg11p)为靶点，通过抑制真菌细胞膜麦角甾醇的生物合成产生抑菌作用。

由碱基突变引起的氨基酸替换可降低Erg11p与唑类药物亲和力，这是白念珠菌对唑类药物产生抗性的常见机制。目前发现与白念珠菌耐药性相关的Erg11p氨基酸取代位点主要包括：Y118A、F126V、Y132F、Y132H、K143R、F145L、P230L、Y257H、D278N、S279F、G307S、S405F、V437I、Y447H、G448E、F449Y、G450E、V456I、G464S、R467K、I471T、Q474K、V488I[4]、D116E、K128T、V159I、E266D[5]。

在白念珠菌中，锌簇转录因子Upc2p在唑类抗真菌药物作用下可调节ERG11和其他参与麦角甾醇生物合成的基因(ERG1、ERG3、ERG4等)的表达。UPC2的功能获得性突变(gain of function, GOF)可导致ERG11等表达增加，使白念珠菌对氟康唑产生耐药性[6]。

1.2 棘白菌素类药物靶点

棘白菌素类药物以β-1, 3-D-葡聚糖合成酶的Fks1亚基为靶点，通过抑制β-1, 3-D-葡聚糖的合成从而破坏白念珠菌细胞壁的完整性。与野生型菌株相比，FKS1热点区域(hot spot, HS)突变的白念珠菌葡聚糖合成酶的合成能力降低且对棘白菌素类耐药[7]，且当耐药菌细胞壁中的几丁质含量升高时，可进一步增强其对棘白菌素类药物的耐药[8]。

然而，Spettel等[9]对115株耐米卡芬净的白念珠菌FKS1的HS1、HS2和HS3区进行突变筛查，均未发现这些热点区域存在错义突变，这提示除了FKS突变之外可能还存在其他棘白菌素类药物耐药机制有待进一步阐明。

2 外排泵基因表达增加

白念珠菌CDR1、CDR2和MDR1基因表达增加可以有效降低细胞内的药物浓度，从而产生耐药[10-11]。Tac1p为调控能量依赖的转运蛋白超家族(ATP-binding cassette, ABC)的关键因子，TAC1发生GOF(如H741D)可上调CDR1和CDR2的表达，介导唑类耐药性的产生[12]。

Flo8p在白念珠菌的形态转换调控中发挥着重要作用，FLO8缺失可引起白念珠菌CDR1和CDR2过表达，并导致对唑类药物耐药[13]。锌簇转录因子Mrr1p以及bZip转录因子Cap1p可调控MDR1的表达，Mrr1p和Cap1p的功能获得性突变均可上调MDR1的表达从而导致白念珠菌耐药[14-16]。此外，转录因子Mrr2p可上调CDR1的表达，从而导致白念珠菌对氟康唑耐药[17]。但近期有研究认为，白念珠菌中野生型或突变型MRR2的过表达并不影响其CDR1的表达以及对氟康唑的敏感性[18]。

zi=β0+β1x1i+β2x2i+β3x3i+β4x4i+β5x5i+β6x6i+β7x7i+β8x8i

ABC转运蛋白Mlt1p定位于白念珠菌的液泡膜，可特异性地将磷脂酰胆碱转运到液泡腔。Mlt1p可将进入到胞浆内的唑类药物转运到液泡中，从而降低细胞内药物的有效浓度以降低药物毒性[19]，当Mlt1p第765位苯丙氨酸的缺失可导致Mlt1p的定位改变，失去原有抗唑类药物的能力。

位于白念珠菌质膜上的转运蛋白CDR6/ROA1能够外排小檗碱、罗丹明等外源物质，CDR6/ROA1缺失突变株可通过激活TOR信号通路以及增加细胞膜的硬度，从而减少细胞内唑类药物的累积，导致菌株对唑类药物耐药[20]。

3 生物膜的形成

生物膜为高度组织化的微生物群落，通常被细胞外基质所包围。细胞外基质既可以阻止抗真菌药物渗透进入细胞内，也可以抵抗宿主的免疫攻击。因此，白念珠菌生物被膜的形成增加了治疗难度，同时也是其致病的主要毒力因素之一[21]。过表达FKS1的生物膜对棘白菌素类和多烯类药物的耐药性增加，提示念珠菌生物膜葡聚糖隔离是一种多药耐药机制[22]。

有研究发现，侵袭性念珠菌病患者机体内白念珠菌生物膜形成可通过抑制中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NET)的形成对中性粒细胞的活性产生抑制作用[23]。

4 钙调神经磷酸酶

真核生物钙调神经磷酸酶是一种钙调素激活的高度保守的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶，是由催化亚基A(calcineurin A, CNA)和调节亚基B(calcineurin B, CNB)组成的杂二聚体。钙调神经磷酸酶作为细胞内信号通路的重要组成部分，参与了包括真菌菌丝生长、耐药、毒力、应激反应等多种生理过程，同时还参与介导了生物被膜对氟康唑的耐药性[24]。研究发现，钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司(FK506)和环孢素A(CsA)对耐药白念珠菌有较强的协同作用[24-25]。钙通道拮抗剂氨氯地平与氟康唑联合应用，可通过下调CNA1和CNB1对耐药白念珠菌有协同作用[26]。

热休克蛋白90(heat shock protein 90, Hsp90)是钙调神经磷酸酶信号网络中的一个重要靶点，它是白念珠菌应激反应中一个关键的细胞调节因子，Hsp90抑制剂格尔达霉素(geldanamycin, GDA)可以显著提高耐棘白菌素的白念珠菌对米卡芬净和卡泊芬净的敏感性[27]。

5 代谢改变

大多数与白念珠菌唑类耐药相关的潜在生物标志物涉及氨基酸代谢、磷脂代谢等代谢过程，与减少内源性活性氧的产生，改变细胞膜和线粒体的功能等相关。

5.1 生物标志物

通过代谢组学分析发现20种代谢物是与耐药性水平相关的潜在生物标志物。在耐唑类药物的白念珠菌中，甘油磷胆碱、谷胱甘肽、次黄嘌呤等13个标志物表达上调，而乳酸盐、肌醇、精胺等表达减少，其中谷胱甘肽、多胺和3-羟基犬尿氨酸的调节会减少细胞内的活性氧，从而降低真菌对药物的敏感性[28]。

5.2 磷脂代谢改变

鞘磷脂是真菌细胞膜的主要成分，与唑类和多烯类抗真菌药物的靶标麦角甾醇在功能上相互作用。Gao等[29]通过构建fen1Δ/Δ和fen12Δ/Δ突变株分别验证了这两个菌株对氟康唑的抗性显著升高。质谱分析表明，这两个突变体的细胞鞘脂组成都发生了变化，包括脂肪酸链较短的几种甘露糖硫代磷酸酰胺的水平大幅增加，这种抗性依赖于鞘脂生物合成基因的上调，揭示了鞘脂代谢在唑类耐药性产生中的作用。

6 线粒体功能改变

白念珠菌有三种特定的呼吸途径:经典呼吸链、替代呼吸链和平行电子传递链。本课题组研究发现，用氰化物阻断白念珠菌经典呼吸途径可诱导替代呼吸，同时增加对唑类药物的耐药性；用水杨基异羟肟酸(SHAM)抑制抗氰呼吸的替代氧化酶(alternative oxidase，Aox)则会增加白念珠菌对唑类药物的敏感性。通过对Aox的诱导和抑制表明，在白念珠菌中替代呼吸途径有助于形成唑类药物的耐药性[30]。Aox酶是真菌特异性的，因此是抗真菌药物理想靶点。

FZO1是白念珠菌线粒体发挥生物功能的关键成分。通过对fzo1Δ/Δ菌株的全基因组表达谱分析发现该菌株Cdr1p迁移至液泡，导致细胞膜上Cdr1p外排泵的活性降低，麦角甾醇生物合成途径的基因下调以及细胞麦角甾醇水平相应降低，从而增加了对唑类药物的敏感性[31]。而正常白念珠菌可能通过改变线粒体的有氧呼吸代谢，增加ATP的产生，减少ROS的产生，从而增强外排泵的活性，进而降低对氟康唑的敏感性[32]。

7 选择性剪接

选择性剪接(alternative splicing，AS)是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程，是真核生物中单个基因产生不同蛋白亚型的过程，真核基因中内含子的存在是选择性剪接的分子基础。

Suraya等[33]对来自相同基因、对唑类药物敏感和耐药的白念珠菌的RNA进行测序，发现ARC19、PHA2和SOD3等14个基因的剪接异构体表达存在差异，且所有基因的剪接异构体在耐药菌株中的表达增加，说明剪接异构体在获得性耐药性过程中的功能十分重要。

8 非整倍体

微生物对一种环境的适应往往会影响到对另一种环境的适应性，这种现象称为交叉适应(cross adaptation)。Yang等[34]发现，在含有抗癌药物羟基脲(HU)环境中存活的白念珠菌同时也可获得对卡泊芬净的耐药性，这种交叉适应的获得与白念珠菌2号染色体三倍体的产生有关；白念珠菌5号染色体单体可导致对氟康唑和卡泊芬净耐药性。此外，我们课题组还发现白念珠菌R染色体三体突变可导致对唑类药物的耐药性[35]。

9 微量元素

在白念珠菌中，镁(Mg)在细胞信号转导、氧化磷酸化等生理中发挥重要作用，缺镁不仅会影响细胞膜外排泵的活性，还会增强对抗真菌药物的敏感性[36]。铜可以特异性增强氟康唑的抗真菌活性[37]，白念珠菌铜敏感转录因子Mac1p通过控制铜的摄入来调控细胞对铜饥饿的反应，而mac1Δ/Δ菌株比其亲本菌株对氟康唑更敏感[38]。

10 微生物菌群

人体的微生物菌群包含细菌、真菌和病毒等多种微生物，不同菌种之间可利用群体感应(quorum sensing, QS)而相互影响。近期研究发现，铜绿假单胞菌的QS因子N-(3-氧碘癸酰)-L-高丝氨酸内酯可通过逆转抗真菌药物对麦角甾醇生物合成途径的影响，诱导白念珠菌对氟康唑产生耐药性[39]。

11 展望与小结

综上所述，白念珠菌耐药问题并非由简单的单一因素引起，其原因往往涉及到多种机制。除药物靶点突变或上调、药物外排增加、生物被膜形成等经典机制外，代谢调节、线粒体功能改变、选择性剪切等机制也受到了广泛关注。近年来不断有研究发现了一些有抗耐药真菌活性的化合物，但往往都是通过这些化合物来寻找相关靶点，鲜有通过新发现的耐药靶点设计合成新颖结构先导化合物的研究。随着白念珠菌耐药机制研究的不断发展和深入，全新的耐药机制和药物靶点被不断阐释和开发，有望为研究全新结构的抗真菌药物和开发更多有效的抗耐药真菌策略提供新的方法与思路。