二肽基肽酶-4通过CXCR4/mTOR信号通路介导小鼠肺泡巨噬细胞MH-S自噬的机制研究

2022-08-31杨帆邓璐陈睦虎

中国现代医学杂志 2022年16期

杨帆，邓璐，陈睦虎

（西南医科大学附属医院1.急诊科，2.甲状腺外科，四川泸州 646000）

肺巨噬细胞是免疫细胞的一种，能够吞噬外来病原体及人体衰老的细胞，同时肺巨噬细胞参与特异性免疫，刺激细胞因子的分泌[1-2]。多种肺疾病的病理特征均由炎症细胞及细胞因子导致，在其发病过程中，肺巨噬细胞发挥着重要作用。目前认为肺巨噬细胞在一些细菌或有害物质的刺激下，分泌大量炎症因子，部分因子又可趋化中性粒细胞等向肺部迁移，最终引起气道炎症或损伤，加重疾病[3]。因此，有效抑制炎症因子的释放对肺疾病的治疗具有重要意义。自噬是调节肺巨噬细胞吞噬、杀伤，以及调节细胞因子的重要机制，能够调控机体免疫系统[4]。本课题组前期研究发现，脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）能诱导肺巨噬细胞自噬。目前有多项研究表明，肺损伤及炎症反应与肺巨噬细胞炎性小体有关，因此推测肺巨噬细胞的自噬过程能够调控炎症反应[5-6]。二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4,DPP-4）在肺巨噬细胞中大量表达，参与细胞免疫、自噬等多种生物学过程，目前DPP-4 对趋化因子及细胞因子的调控作用已得到证实[7-8]。本研究探究DPP-4 通过CXCR4/mTOR 通路对小鼠肺巨噬细胞自噬的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及培养

小鼠肺泡巨噬细胞MH-S 购自上海酶研生物科技有限公司。取出液氮冻存的MH-S 细胞，恢复至室温后转移至25 mL 培养瓶，同时加入15 mL 含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM）培养液，在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养24 h。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂DPP-4 表达病毒、si-DPP-4 病毒载体（上海钰博生物科技有限公司），白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-ɑ,TNF-ɑ）酶联免疫试剂盒（上海广锐生物科技有限公司），转染试剂盒（上海研卉生物科技有限公司），TRIzol、逆转录试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）试剂盒（上海一研生物科技有限公司），DPP-4、mTOR 兔抗大鼠一抗（1 mg/mL）及山羊抗兔二抗（1 mg/mL）（上海圻明生物科技有限公司），CXCR4兔抗大鼠一抗（1 mg/mL）及山羊抗兔二抗（1 mg/mL）（上海康朗生物科技有限公司）。

1.2.2 主要仪器倒置荧光显微镜（型号：Echo Revolve，北京普迈精医科技有限公司），酶标仪（型号：LONZA ELx808，北京泽平科技有限责任公司），全自动生化分析仪（型号：PUZS-300，上海帝博思生物科技有限公司）。

1.3 细胞分组及干预

取对数生长期的MH-S 细胞，接种于6 孔板，每孔取1×105个细胞继续贴壁生长，当细胞融合75%～85%时进行转染。分别设置PBS 组、LPS 组、DPP-4 组，si-DPP-4 组、DPP-4 + BafA1 组及si-DPP-4+BafA1 组。

PBS 组仅为PBS 培养的MH-S 细胞；LPS 组在MH-S 细胞中加入100 ng/mL LPS，诱导培养24 h；DPP-4 组在LPS 组的基础上，加入100 nmol/L DPP-4表达病毒转染MH-S 细胞；si-DPP-4 组在LPS 组的基础上，加入100 nmol/L si-DPP-4 病毒载体转染MH-S 细胞；DPP-4 + BafA1 组在LPS 组的基础上，在DPP-4 表达病毒转染MH-S 细胞中加入自噬抑制剂BafA1 干预；si-DPP-4 + BafA1 组在LPS 组的基础上，在si-DPP-4 病毒载体转染的MH-S 细胞中加入自噬抑制剂BafA1 干预。

1.4 细胞转染

根据细胞分组进行操作，每孔加入1 mL 病毒稀释液（病毒感染复数=100，DMEM 培养液1∶99），具体操作步骤参考转染试剂盒说明书，转染48 h 后，采用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）检测转染效率，当转染效率＞70%时，可用于后续实验[9]。

1.5 酶联免疫吸附试验检测MH-S 细胞上清液炎症因子水平

取各组MH-S 细胞培养液，离心取上清液，采用酶联免疫吸附试验试剂盒检测MH-S 细胞IL-1β、IL-6 及TNF-ɑ 水平，向稀释后的标准品中加入MH-S 细胞上清液50 μL，混匀后于恒温水浴锅中温育0.5 h，分别加入50 μL 酶标志物、50 μL 显色剂A、50 μL 显色剂B 及50 μL 终止液，用酶标仪检测各孔450 nm 处吸光度，根据IL-1β、IL-6 及TNF-ɑ 的标准曲线计算其相应浓度[10]。每组有4 个复孔，实验均重复3 次，取均值。

1.6 腺病毒检测MH-S细胞自噬流变化

取各组稳定转染的MH-S 细胞，接种于12 孔板上，孔内铺放细胞爬片，加入携带mRFP-GFP-LC3的腺病毒，进行贴壁生长，当细胞融合度为70%时，移除上清液，PBS 冲洗3 次，加入4%多聚甲醛固定，再冲洗3 次，加入抗荧光猝灭封片液进行封片，于荧光显微镜下观察自噬流的变化，即GFP、红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）及其合并通道（黄色）[11]。GFP 减弱表明自噬小体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。

1.7 qRT-PCR 检测DPP-4、CXCR4、mTOR mRNA的表达

取各组稳定转染的MH-S 细胞，采用TRIzol 试剂盒提取MH-S 细胞总RNA，检测RNA 浓度及纯度。采用逆转录试剂盒，以RNA 为模板，通过逆转录得到cRNA。设置20 μL 的PCR 反应体系：cDNA模板1 μL，SYBR 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，纯水8 μL；反应体系设置完成后进行扩增，反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 个循环。根据2-ΔΔCt法计算DPP-4、CXCR4、mTOR 相对表达量[12]，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 Western blottig 检测CXCR4/mTOR 通路蛋白的表达

取各组稳定转染的MH-S 细胞，加入适量裂解液裂解混匀，裂解MH-S 细胞，1 500 r/min 离心20 min，取上清液进行免疫凝胶电泳，分离CXCR4、mTOR 蛋白条带，并采用湿膜法转移到PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，将PVDF 膜分别在含有一抗（1∶500 稀释）及二抗（1∶1 000 稀释）的孵育盒中孵育，孵育后PBS 冲洗3 次进行显影、定影，分析相应灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白/β-actin 灰度值[13]。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 MH-S细胞转染情况

正常MH-S 细胞形态均匀，呈梭形，而转染后细胞一般成簇存在，呈漩涡样生长，经绿色荧光蛋白标记后，细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光。见图1。

图1 MH-S细胞转染图（左图：×100，右图：×200）

2.2 各组MH-S细胞上清液炎症因子水平比较

各组IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：LPS 组IL-1β、IL-6 及TNF-α 高于PBS 组（P＜0.05）；DPP-4 组与LPS 组IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；si-DPP-4 组IL-1β、IL-6 及TNF-α 高于LPS 组（P＜0.05）；si-DPP-4组和DPP-4 + BafA1 组IL-1β、IL-6 及TNF-α 高于DPP-4 组（P＜0.05）；si-DPP-4 + BafA1 组IL-1β、IL-6高于si-DPP-4 组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组MH-S细胞上清液炎症因子水平比较（ng/mL，±s）

注：①与PBS组比较，P＜0.05；②与LPS组比较，P＜0.05；③与DPP-4组比较，P＜0.05；④与si-DPP-4组比较，P＜0.05。

TNF-α 0.17±0.02 0.40±0.05①0.22±0.03 0.63±0.07②③0.96±0.10③0.77±0.08 66.532 0.000组别PBS组LPS组DPP-4组si-DPP-4组DPP-4+BafA1组si-DPP-4+BafA1组F 值P 值IL-1β 0.24±0.03 0.87±0.10①0.78±0.09 1.59±0.17②③1.27±0.13③1.83±0.19④36.789 0.000 IL-6 0.13±0.02 1.43±0.15①0.80±0.09 2.06±0.22②③1.18±0.13③2.81±0.30④53.456 0.000

2.3 各组MH-S细胞自噬流的变化

各组MH-S 细胞GFP、RPF 及Merge 数量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：LPS 组GFP、RPF 及Merge 数量高于PBS 组（P＜0.05）；DPP-4 组GFP、RPF 及Merge 数量高于LPS 组（P＜0.05）；si-DPP-4 组GFP、RPF 及Merge 数量低于LPS 组（P＜0.05）；si-DPP-4 组和DPP-4+BafA1 组GFP、RPF 及Merge 数量低于DPP-4组（P＜0.05）；si-DPP-4 + BafA1 组GFP、RPF 及Merge数量低于si-DPP-4 组（P＜0.05）。见表3和图2。

图2 各组MH-S细胞自噬流的变化（×400）

表3 各组MH-S细胞GFP、RPF及Merge数量比较（个/细胞，±s）

注：①与PBS组比较，P＜0.05；②与LPS组比较，P＜0.05；③与DPP-4组比较，P＜0.05；④与si-DPP-4组比较，P＜0.05。

组别PBS组LPS组DPP-4组si-DPP-4组DPP-4+BafA1组si-DPP-4+BafA1组F 值P 值Merge 104.83±10.68 171.66±17.83①199.67±20.56②97.68±9.96②③138.34±15.75③77.98±8.02④318.456 0.000 GFP 106.68±0.07 169.70±0.08①221.64±0.17②95.75±0.04②③133.58±0.17③79.45±8.17④364.897 0.000 RPF 156.97±16.86 201.55±22.64①274.75±30.54②138.73±14.47②③189.29±18.68③119.68±21.65④495.588 0.000

2.4 各组MH-S 细胞DPP-4、CXCR4、mTOR mRNA相对表达量比较

各组DPP-4、mTOR、CXCR4 mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：LPS 组CXCR4、mTOR mRNA相对表达量高于PBS 组（P＜0.05）；DPP-4 组DPP-4 mRNA 相对表达量高于LPS 组（P＜0.05），CXCR4、mTOR mRNA 相对表达量低于LPS 组（P＜0.05）；si-DPP-4 组DPP-4 mRNA 相对表达量低于DPP-4 组（P＜0.05），CXCR4、mTOR mRNA 相对表达量高于DPP-4 组（P＜0.05）；DPP-4 + BafA1 组CXCR4、mTOR mRNA 相对表达量高于DPP-4 组（P＜0.05）；si-DPP-4 + BafA1 组CXCR4、mTOR mRNA 相对表达量高于si-DPP-4 组（P＜0.05）。见表4。

表4 各组M H-S细胞DPP-4、CXCR4、mTOR mRNA相对表达量比较（±s）

注：①与PBS组比较，P＜0.05；②与LPS组比较，P＜0.05；③与DPP-4组比较，P＜0.05；④与si-DPP-4组比较，P＜0.05。

mTOR mRNA 0.83±0.09 1.26±0.13①1.02±0.10②1.58±0.16②③1.34±0.13③1.86±0.18④49.656 0.000组别PBS组LPS组DPP-4组si-DPP-4组DPP-4+BafA1组si-DPP-4+BafA1组F 值P 值DPP-4 mRNA 0.68±0.07 0.70±0.08 1.64±0.17②0.33±0.04②③1.58±0.17 0.35±0.04 132.456 0.000 CXCR4 mRNA 0.74±0.08 1.15±0.12①0.92±0.10②1.47±0.15②③1.23±0.13③1.73±0.18④73.456 0.000

2.5 各组MH-S 细胞CXCR4/mTOR 通路蛋白相对表达量比较

各组CXCR4、p-mTOR/mTOR 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：LPS 组CXCR4、p-mTOR/mTOR 蛋白相对表达量高于PBS 组（P＜0.05）；DPP-4组CXCR4、p-mTOR/mTOR 蛋白相对表达量低于LPS组（P＜0.05）；si-DPP-4 组和DPP-4 + BafA1 组CXCR4、p-mTOR/mTOR 蛋白相对表达量高于DPP-4组（P＜0.05）；si-DPP-4 + BafA1 组CXCR4、p-mTOR/mTOR 蛋白相对表达量高于si-DPP-4 组（P＜0.05）。见表5和图3。

图3 各组MH-S细胞CXCR4/mTOR通路蛋白的表达

表5 各组MH-S细胞CXCR4/mTOR通路蛋白相对表达量比较（±s）

注：①与PBS组比较，P＜0.05；②与LPS组比较，P＜0.05；③与DPP-4组比较，P＜0.05；④与si-DPP-4组比较，P＜0.05。

p-mTOR/mTOR蛋白0.28±0.03 0.48±0.05①0.31±0.04②0.87±0.09②③0.83±0.09③0.97±0.10④104.567 0.000组别PBS组LPS组DPP-4组si-DPP-4组DPP-4+BafA1组si-DPP-4+BafA1组F 值P 值CXCR4蛋白0.23±0.04 0.62±0.07①0.47±0.05②0.79±0.09②③0.81±0.09③0.93±0.10④89.457 0.000

3 讨论

细胞自噬是机体重要的生物学过程，能够调节细胞代谢平衡，促进增殖分化等，在非生理状态下自噬作用被激活，能够调控多种细胞因子，发挥保护细胞的作用[14]。肺巨噬细胞在免疫应答过程中发挥重要作用。多数研究认为，肺巨噬细胞的自噬作用在动脉粥样硬化、尘肺及癌症等多种疾病中均有积极作用[15]。DPP-4 在肺巨噬细胞中大量表达，在细胞自噬过程中具有一定作用。在郑文彬[16]的研究中，DPP4 抑制剂（西格列汀）具有降糖作用，同时还可以通过抑制NF-κB 和JNK/AP1 通路减轻肝脏炎症，上调AMPK/mTOR 信号通路增强细胞自噬作用，进而改善肝脂肪变性，表明DPP-4 参与细胞炎症及自噬作用的调节过程。国外有研究显示，DPP-4 对mTOR 通路有一定的调控作用[17]，因此推测DPP-4可能通过mTOR 通路介导小鼠肺泡巨噬细胞MH-S自噬。CXCL12 是DPP-4 底物中的一种，而CXCR4是CXCL12 的特异性受体，在肺巨噬细胞中高表达，相关研究表明，CXCR4/mTOR 信号能够对肿瘤相关巨噬细胞发挥调控作用[18]。

在马晓娟等[19]研究中显示，DPP-4 抑制剂能有效降低血糖并抑制血清肺巨噬细胞移动抑制因子水平，从而发挥抗炎作用，对糖尿病合并冠状动脉粥样硬化性心脏病患者起到一定的保护作用。黄玉芳等[20]研究显示，DPP-4 抑制剂能够下调小鼠肺巨噬细胞系RAW264.7 细胞的炎症反应，其作用机制与PKA/NF-κB 通路有关。上述研究均显示，DPP-4 对小鼠肺巨噬细胞具有一定的抗炎作用。本研究中同样对各组MH-S 细胞炎症因子水平进行检测，其中LPS 组IL-1β、IL-6 及TNF-α 明显高于PBS组，表明MH-S 细胞在LPS 的诱导下激活细胞炎症反应，释放大量炎症因子，分析其原因为LPS 是内毒素的主要成分，能够与细胞中多种受体结合，诱导细胞炎症反应的发生。与LPS 组比较，DPP-4 组炎症因子水平呈下降趋势，但无统计学意义，而si-DPP-4 组炎症因子水平升高，说明DPP-4 对细胞炎症水平具有一定的抑制作用，但抑制作用较弱，导致各组炎症因子变化不明显，而抑制DPP-4 表达能够促进炎症反应的发生。与DPP-4 组比较，si-DPP-4 组和DPP-4 + BafA1 组IL-1β、IL-6 及TNF-α 升高，提示抑制DPP-4 表达能够促进炎症反应，DPP-4 在自噬抑制剂的作用下，同样有促炎作用，反向说明DPP-4 高表达和细胞自噬均有抗炎作用。与si-DPP-4 组比较，si-DPP-4 + BafA1 组IL-1β、IL-6 降低，表明在DPP-4 低表达情况下，抑制细胞自噬作用相较于炎症反应的促进作用更强，进一步说明DPP-4 高表达与细胞自噬均有抗炎作用。

CXCL12/CXCR4 通路在肿瘤转移、炎症、免疫等过程中发挥重要作用。国外有研究显示，抑制DPP-4表达能够通过CXCL12/CXCR4/mTOR 通路促进上皮间质转化，加速乳腺癌细胞转移，且能够增加乳腺癌细胞的化疗耐药性[21-22]。本研究对MH-S 细胞自噬流、CXCR4/mTOR 通路mRNA 和蛋白进行检测，结果显示，经过LPS 诱导，细胞自噬流升高，mTOR mRNA、CXCR4 mRNA、p-mTOR 蛋白、CXCR4 蛋白表达上调，表明在炎症反应的刺激下，CXCR4/mTOR 通路部分被激活，而在DPP-4 过表达的情况下，自噬流进一步升高，通路mRNA 和蛋白表达进一步上调，表明DPP-4 能够有效激活CXCR4/mTOR 通路，促进细胞自噬；而在DPP-4 低表达的情况下，自噬作用受到抑制。另外本研究在DPP-4 过表达及低表达的情况下给予自噬抑制剂，结果显示，两种情况下细胞自噬流及通路蛋白表达均下调，进一步说明DPP-4 能够通过CXCR4/mTOR 通路对MH-S 细胞自噬作用进行调控。

综上所述，DPP-4 能够通过调控小鼠肺巨噬细胞自噬作用影响细胞炎症因子分泌，其作用机制与CXCR4/mTOR 通路有关，未来可对DPP4 抑制剂的抗炎作用进行深入研究，为炎症性疾病的治疗提供新的研究思路。