甘草酸对大鼠急性肺水肿的影响*

雷艳丽，张俊，黎伟华，杨丽

（宁夏医科大学 实验动物中心，宁夏 银川 750004）

急性肺损伤由脓毒症、肺炎、急性胰腺炎及外伤等造成[1-2]。其伴有急性炎症、微血管损伤，增加肺血管和上皮细胞通透性，引起呼吸衰竭，可能发展为致命性急性呼吸窘迫综合征[3]。甘草作为经典的呼吸疾病治疗中药，具有镇咳祛痰、治疗咳嗽、支气管炎等作用。甘草酸又名甘草甜素，是甘草的甜味成分亦是含量最高的苷类化合物[4]，主要用于抗肝炎病毒、抗艾滋病毒、抗癌、防癌、增强免疫力等领域[5-6]。有关研究表明，甘草酸保护急性肺损伤的主要机制是通过其类激素样抗炎作用[7]，关于甘草酸对呼吸参数的影响尚未见到文献报道。本研究拟通过氯化胺诱导大鼠急性肺损伤模型，观察模型大鼠肺功能指标的变化，探讨甘草酸对大鼠急性肺水肿的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

DSI Buxco PFT 肺功能检测仪（美国DSI 公司），ABS210S 电子天平（德国Sartorius 公司），ASP200S 全自动密闭组织脱水机、HistoCore Arcadia组织包埋机、RM2245 半自动石蜡切片机（德国Leica 公司），Milli-Q 超纯水处理系统（美国Millipore公司）。甘草酸原料药（批号JZ20131026，纯度90%，南京景竹生物科技有限公司），氯化铵（批号20170806，上海光诺化学科技有限公司），0.9%氯化钠注射液（山东科伦药业有限公司），4%多聚甲醛溶液（北京雷根生物技术有限公司），实验用水均为超纯水。

1.2 动物

SPF 级雄性SD 大鼠，18 只，6～8 周龄，体重180～220 g，购自宁夏医科大学实验动物中心，实验动物使用许可证号SYXK（宁）2020-0001，实验动物生产许可证号SCXK（宁）2020-0001。饲养环境温度18～22℃，湿度40%～70%，保持自然昼夜节律光照（12 h/12 h），大鼠自由摄食饮水。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与药物处理将大鼠随机分为对照组、模型组、甘草酸预防组[8-9]。甘草酸组灌胃100 mg/kg 的甘草酸7 d，对照组和模型组口服灌胃等体积水。模型组和甘草酸组大鼠第8 天腹腔注射6%氯化胺（100 g/0.6 mL），复制急性肺水肿模型；对照组注射等体积生理盐水。注射30 min 后，观察各组大鼠的状态、行为。

1.3.2 大鼠肺功能检测待行为学观察结束后，大鼠腹腔注射10%乌拉坦，麻醉后切开颈部皮肤，钝性分离暴露气管，气管T 字开口并插管，采用手术缝合线结扎开口（保证密闭性），将大鼠放入肺功能仪自带密闭腔体中，气管插管与气路连接，通过DSI Buxco PFT 肺功能检测仪实时监测并记录大鼠肺功能指标，包括一般指标[10-11]：肺功能残气量（FRC）、最大变化压力（DPmax）、最大变化体积（DVmax）、阻塞时间（Tocclude）；肺内压力-容积：静态肺顺应性（Cchord）、深吸气量（IC）、肺活量（VC）；肺内呼气流速-容积：最大呼气流速（PEF）、用力肺活量（FVC）、用力呼吸残气量（FERV）和20 毫秒用力呼气容积（FEV0.02）和100 毫秒用力呼气容积（FEV0.1）。

1.3.3 动物取材打开大鼠胸腔，完整剪取肺组织，用预冷生理盐水冲洗，使用滤纸吸干、拍照。再将肺组织分为左、右叶。右叶肺组织用4%多聚甲醛固定，苏木精-伊红（hematoxylineosin,HE）染色，左肺组织上叶用电子天平称湿重后置于玻璃皿中测定肺含水量，左肺组织下叶于-80℃冰箱冷冻保存，用于其他指标的检测[12-13]。

1.3.5 肺损伤及其肺水肿评估根据SD 大鼠肺叶组织的湿重/干重（W/D）评估肺水肿程度[14]。①湿重测量：取出处死大鼠右肺下叶组织，使用无菌纱布吸取表面组织液体，天平测量其湿重；②干重测量：将处理后的肺叶组织放入80℃恒温烤箱烘烤48 h，待其衡重后称重。肺组织含水率（%）=（肺组织湿重-肺组织干重）/肺组织湿重×100%。

1.3.6 肺组织病理学观察取右叶肺组织，用4%多聚甲醛溶液固定，固定组织应充分展开，切勿挤压和冷冻，室温固定3 d后，切取肺组织块2～4 mm，常规脱水，石蜡包埋、切片、HE 染色后，在光学显微镜下观察大鼠肺泡间隔病变、炎症细胞浸润、血管瘀血状况等组织病理学变化[12-13]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能一般指标比较

各组大鼠FRC、DPmax、DVmax比较，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组低于正常组和甘草酸组。各组大鼠Tocclude 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肺功能一般指标比较 （n=6，±s）

表1 各组大鼠肺功能一般指标比较 （n=6，±s）

组别正常组模型组甘草酸组F 值P 值FRC/mL 8.993±0.152 6.619±0.854 9.304±0.411 31.991 0.000 DPmax/cmH2O 34.013±1.119 18.729±1.586 19.967±0.844 167.552 0.000 DVmax/mL 0.340±0.009 0.128±0.041 0.202±0.012 59.501 0.000 Tocclude/s 5.533±0.173 6.608±0.193 5.977±0.724 1.255 0.320

2.2 各组大鼠肺内压力-容积比较

各组大鼠肺Cchord、IC、VC 比较，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组低于正常组、甘草酸组。见表2。

表2 各组大鼠肺内压力-容积比较 （n=6，±s）

表2 各组大鼠肺内压力-容积比较 （n=6，±s）

组别正常组模型组甘草酸组F 值P 值Cchord/（mL/cmH2O）1.443±0.039 0.737±0.253 0.964±0.014 18.404 0.000 IC/mL 18.961±0.491 11.813±1.425 12.896±0.096 60.780 0.000 VC/mL 21.730±0.397 13.242±1.835 15.650±0.080 50.522 0.000

2.3 各组大鼠肺内呼气流速-容积比较

各组大鼠PEF、FVC、FERV、FEV0.1比较，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组PEF、FERV、FEV0.1高于正常组，但低于甘草酸组，模型组FVC低于正常组、甘草酸组。各组大鼠FEV0.02比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠肺内呼气流速-容积比较 （n=6，±s）

表3 各组大鼠肺内呼气流速-容积比较 （n=6，±s）

组别正常组模型组甘草酸组F 值P 值PEF/（mL/s）81.349±2.769 100.833±7.358 118.473±1.490 57.679 0.000 FVC/mL 19.699±0.260 12.310±1.801 14.748±0.035 40.049 0.000 FERV/mL 0.228±0.095 0.649±0.343 1.912±0.102 67.949 0.000 FEV0.02/mL 0.574±0.384 0.766±0.373 1.014±0.022 2.564 0.118 FEV0.1/mL 6.790±0.684 8.350±1.258 10.157±0.081 16.449 0.000

2.4 各组大鼠肺组织变化

正常组大鼠呼吸均匀，无异常现象，解剖无异常。模型组注射6%氯化铵后，大鼠口角流出血色泡沫，解剖发现呼吸道内充满泡沫液体，说明血浆透过肺血管进入呼吸道。模型组肺组织外形肿大，中间有淤血，部分肺组织边缘还有明显的损伤或坏死。甘草酸组大鼠口角未见太多泡沫，活动正常，解剖发现肺组织水肿程度明显降低，出血点显著减少或消失，且未见模型组中所观察到的肺损伤或坏死现象。见图1。

图1 各组大鼠肺组织变化

2.5 各组大鼠W/D比较

正常组、模型组、甘草酸组大鼠肺组织含水率分别为（4.56±1.57）%、（7.83±0.86）%、（5.24±0.66）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=15.796，P=0.004），模型组高于正常组、甘草酸组。

2.6 各组大鼠肺组织的病理切片

正常组大鼠的肺组织结构完整、纹理清晰、肺泡腔完全无水肿，无特殊的改变。模型组大鼠肺中出现大量水肿，肺泡壁断裂，肺泡隔显著变大。口服甘草酸预防治疗后，上述现象得到了改善。见图2。

图2 各组大鼠肺组织病理切片 （HE染色）

3 讨论

氯化铵会引起心动过速，进而使得注入左心室的血液无法充分排出，逐渐增大其舒张期末压力，导致右心房压力提高而产生淤血于肺静脉中。在过往研究中，肺水肿可致动物在呼吸过程中，产生难以消除的泡沫，泡沫形成速度快，严重影响呼吸，进而导致呼吸异常甚至致死[14-15]。所以清除呼吸道内的泡沫可减轻呼吸阻塞，改善呼吸，进而挽救生命。肺水肿是急性肺损伤最显著的特征[16]。肺水肿导致的顽固性低氧血症对患者影响严重，目前尚无有效的药物治疗，仅有小潮气量肺保护性通气和俯卧位通气2 种方法有明显疗效[17-19]。

我国传统中药甘草的主要活性成分为甘草酸，其为五环三萜皂苷类。临床上用于治疗急性、慢性病毒性肝炎，可用于保肝等[20]。文献报道，甘草酸对ALL 具有良好的保护作用，主要是通过降低肺水肿的致死率[5，21-23]。本研究发现，经甘草酸预防给药的复制肺水肿模型大鼠肺部炎症明显缓解。甘草酸具有类激素样受体的抗炎作用，文献报道，糖皮质激素改善急性肺损伤小鼠肺功能，可以延缓气道压力升高，增加肺容积、气道阻力、2 秒末用力呼气容积、最大呼气中期流速、用力最大呼气流速，减少最大吸气流量、最大呼气中期时间[24-25]。

综上所述，SD 大鼠给予氯化铵后，肺功能检测仪可全面观测到大鼠肺功能指标的变化。甘草酸可通过改善肺通气量，减弱肺表面的水肿程度来缓解大鼠急性肺水肿，减少炎症细胞浸润。