基于荧光纳米粒子的新型冠状病毒核衣壳蛋白免疫层析快速检测试剂的研制①

张 赛 王 刚 刘仲明 李辉军 钱纯亘 （深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司，深圳 518116）

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是正链单股RNA病毒，是已知基因组最大的RNA 病毒之一，有包膜，属冠状病毒科。该科分为α、β、δ 和γ 4 个属，SARSCoV-2为β属，可引起新型冠状病毒性肺炎（COVID-19）［1］。目前SARS-CoV-2 检测技术主要有分子诊断的荧光定量PCR 技术（RT-PCR）、基因测序技术、基因编辑技术及免疫学检测的免疫层析法、化学发光法和酶联免疫吸附法［2-12］。COVID-19确诊病例诊断的“金标准”是病毒核酸的检出，不过，受样本类型、样本质量和检测技术等方面因素限制，基于核酸的检测存在一定程度的“假阴性”［13］。研究显示感染SARS-CoV-2 后，人体会在约7 d 时产生针对病毒的IgM 抗体，约14 d 会产生病毒的IgG 抗体，可见基于免疫学的抗体检测对于病毒的早期筛查并不适用［14］。在实际诊断过程中，抗体检测法也暴露出较多的假阳性问题，不能单独作为诊断指标用于筛查，只能作为当核酸检测为阴性时的辅助诊断方法［15-16］。由于核酸检测和抗体检测在诊断中所暴露出的问题，除CT 等临床症状指标外，临床医生急需一种能够快速诊断COVID-19 的方法，以实现对人群的大规模筛查。

基于免疫学的抗原快速检测技术采用双抗体夹心法，可有效提高免疫学方法的特异性，减少假阳性的发生；检测一个样本仅需10～20 min，可以做到现场快检，操作简便，无需特殊设备和人员培训；同时由于抗原蛋白较稳定，相对于核酸检测技术对样本的要求也相对较低［17-19］。目前国内外已上市的抗原快速检测试剂检测灵敏度差异较大（30.2%～93.9%），检测灵敏度偏低与样本病毒载量及试剂盒质量均有关系［9，20］。本研究采用荧光层析双抗体夹心法研制SARS-CoV-2 N蛋白抗原快速检测试剂盒，并对试剂盒的性能指标进行了系统地验证，以评估试剂盒在快速诊断COVID-19的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 在希腊ROUMPEA 医学实验室对有临床症状的SARS-CoV-2 患者及其密切接触者进行双份鼻咽拭子样本采集，一份用于核酸检测，一份用本研究所制备的抗原检测试剂盒的检测，共计89 例；另外用同一批试剂卡对本公司采集的291例健康人群鼻拭子样本进行检测。

1.1.2 试剂与仪器 2-（N-吗啉）乙磺酸（MES）、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白钠盐（Casein sodium salt）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、Nonidet P 40（NP-40）、Proclin300 购自美国Sigma 公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；海藻糖、Tween 20、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾购自国药集团上海化学试剂有限公司；羧基荧光纳米粒子购自美国Ocean NanoTech 公司；羊抗N 蛋白多克隆抗体、鼠抗N 蛋白单克隆抗体、N 全长重组蛋白购自菲鹏生物有限公司；鸡IgY和羊抗鸡IgY 抗体购自南京京达生物技术有限公司；SARS-CoV-2灭活培养物购自美国ATCC；其他试剂均为分析纯。

Legend Micro 21R 高速微量离心机购自美国Thermo Scientific 公司；XYZ 三维划膜喷金仪、吸水纸及PVC 底板购自上海金标生物科技有限公司；HGS201 切条机购自杭州峰航科技有限公司；超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q 超纯水机购自美国Millipore 公司；纳米粒度及Zeta 电位分析仪购自英国Malvern 公司；UNICELL-S 荧光免疫分析仪购自深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司；玻璃纤维素膜购自芬兰Ahlstrom公司；硝酸纤维素购自德国Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 荧光纳米粒子标记偶合物的制备 采用EDC/NHS 法制备荧光纳米粒子抗体偶合物［21］。取1 ml（1%）羧基荧光纳米粒子于2 ml 低吸附离心管中，12 000 r/min 离心10 min，去除上清，加入1 ml MES 缓冲液（50 mmol/L，pH=6.0），超声分散；加入EDC、Sulfo-NHS 各5 mg，25 ℃恒温振荡反应20 min，12 000 r/min离心10 min，去除上清，再加入1 ml MES缓冲液（50 mmol/L，pH=6.0），超声分散，12 000 r/min离心10 min，去除上清，重复1 次以除去多余的EDC、Sulfo-NHS。

取活化后的荧光纳米粒子，加入1 ml MES 缓冲液（50 mmol/L，pH6.5），超声分散；加入0.4 mg 羊抗N 蛋白多克隆抗体或鸡IgY 抗体，25 ℃恒温振荡反应2 h，12 000 r/min离心10 min，去除上清；加入1 ml封闭液（50 mmol/L Tris，pH=8.0，0.5% BSA），超声分散，12 000 r/min 离心10 min，去除上清；加入1 ml保存液（50 mmol/L Tris，pH=8.0，0.5%酪蛋白钠盐，0.1%Tween 20，10%海藻糖，0.05%Proclin300），超声分散，4 ℃避光保存。

1.2.2 荧光偶合物颗粒平均直径及Zeta 电位测试 用超纯水将荧光纳米粒子和标记后的荧光纳米粒子抗体偶合物稀释100 倍，取1 ml 加入比色皿中，放入纳米粒度仪测定颗粒的平均直径、分布系数PDI及Zeta电位。

1.2.3 抗原检测试剂的制备 将玻璃纤维素膜用样本垫处理液涂布处理，45 ℃烘干12 h。用偶合物稀释液稀释荧光纳米粒子标记的羊抗N蛋白多克隆抗体偶合物和鸡IgY 抗体偶合物，体积占比分别为15%和2%，用XYZ 三维划膜喷金仪按4 μl/cm 在偶合物垫上平行喷两条线，45 ℃干燥24 h。用含有0.01 mol/L pH7.4 PBS，5%海藻糖的包被液分别稀释鼠抗N 蛋白单克隆抗体、羊抗鸡IgY 抗体至2.0 mg/ml和1.0 mg/ml，分别作为检测线（T线）和质控线（C 线）捕获抗体包被在硝酸纤维膜（NC 膜）上，45 ℃烘干48 h。将制备好的NC 膜、偶合物垫、样本垫及吸水垫依次粘贴在PVC 底板上，用切条机裁切为4.0 mm/条，装入检测卡，铝箔袋封装。

测试时将鼻拭子或鼻咽拭子插入预装有提取液（10 mmol/L PBS，pH=7.4，1% NP-40）的提管中，抽提15 s后滴加3滴（100 μl）至检测卡加样孔，反应15 min 后进行荧光免疫分析仪测试。试剂ID 卡内置临界信号值，样本信号与临界信号（阴性样本信号值加3 倍标准偏差）的比值作为测试结果，单位“COI”，结果≥1 COI 为阳性，＜1 COI 为阴性。试纸条结构、原理及测试过程如图1、图2所示。

图1 试纸条结构及原理图Fig.1 Schematic diagram of structure and principle of antigen test strip

图2 测试过程Fig.2 Procedure for assay

1.2.4 最低检出限 用健康人群鼻拭子洗脱液作为阴性基质将N 全长重组蛋白从1 000 pg/ml 2 倍梯度稀释，每个浓度取100 μl 加样，重复10 次，以N 蛋白浓度为横坐标，荧光信号T/C 值为纵坐标建立标准曲线。参照CLSI E17-A2 文件［22］进行最低检出限研究，LOD=LOB+1.653×SDlowpositive。其中LOB为空白限，选择5 个空白样本，每个样本测试4 次，连续测试3 d，共60 个结果；SDlow positive为低浓度样本标准偏差，选择5 个低值样本，每个样本测试4 次，连续测试3 d，共60个结果。

用热灭活病毒培养物（ATCC，货号VR-1986HKTM，批号70036071，浓度1.6×105TCID50/ml）进行最低检出限研究。选用健康人群鼻拭子洗脱液作为阴性基质，先10 倍梯度稀释，测试出现阴性结果后从上一浓度再2 倍梯度稀释，选择20 次测试中≥19 次阳性的浓度水平（≥95%）作为试剂的最低检出限。

1.2.5 交叉反应分析 本实验室收集的肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、冠状病毒OC43、冠状病毒229E、冠状病毒NL63、甲型H1N1 流感病毒、甲型H3N2 流感病毒、新型甲型H1N1 流感病毒（2009）、乙型流感Victoria、乙型流感Yamagata、呼吸道合胞病毒A 型、呼吸道合胞病毒B 型、腺病毒3 型共计16 种呼吸道病原体高浓度毒株进行交叉反应测试，每个病原体测试1次。

1.2.6 重复性测试 选择62.5 pg/ml 和500 pg/ml两个浓度的N 蛋白参考品进行重复性测试，每个浓度重复测试10次，统计变异系数（CV%）。

1.2.7 临床性能评价 在希腊ROUMPEA 医学实验室用圣湘生物iPonatic 快速核酸检测系统及本研究所制备的抗原检测试剂盒同时取鼻咽拭子样本进行临床比对测试；用同一批试剂卡对本公司采集的291例健康人群鼻拭子样本进行特异性检测。

1.3 统计学分析 使用IBM SPSS20.0 软件对数据进行统计分析，采用Kappa检验，统计分析所研制的新型冠状病毒抗原检测试剂的临床性能。

2 结果

2.1 荧光偶合物粒径和Zeta 电位分析 采用动态光散射法（DLS）表征荧光纳米粒子及荧光纳米粒子偶合物的粒径大小及分布［23］，结果如表1 和图3 所示，荧光纳米粒子的平均直径为（610.80±5.66）nm，分布系数PDI 为0.15±0.02，近单分散体系，表明荧光纳米粒子粒径均一，尺寸分布较窄。Zeta 电位是表征胶体分散系稳定性的重要指标，体系稳定与否通常以Zeta电位是否＞±30 mV为标准［24］，本研究所采用的荧光纳米粒子Zeta 电位为-（42.95±0.78）mV，表明荧光纳米粒子溶液稳定性较好。

从表1和图3中可以看出，羊抗N蛋白多克隆抗体及鸡IgY 荧光纳米粒子偶合物与未标记的荧光纳米粒子相比，粒径和分布系数变化不明显，均尺寸分布较窄，近单分散体系；与荧光纳米粒子相比，羊抗N 蛋白抗体偶合物、鸡IgY 抗体偶合物的Zeta 电位绝对值均增大，体系处于更加稳定的状态，电位增大的原因可能是荧光纳米粒子表面共价结合的抗体蛋白也带负电荷。

图3 荧光纳米粒子及荧光纳米粒子偶合物粒径分布图Fig.3 Particle size distribution of fluorescent nanoparticles and its coupling

表1 荧光纳米粒子及荧光纳米粒子偶合物粒径和Zeta电位Tab.1 Particle size and zeta potential of fluorescent nanoparticles and its coupling

2.2 最低检出限 N 蛋白浓度与信号值T/C 的标准曲线如图4 所示，拟合曲线采用2 次多项式，y=0.036 7+3.819×10-4x-6.456×10-8x2，R2=0.999 1。各浓度N 蛋白峰型图如图5 所示，峰基线平整，各浓度N蛋白T峰区分明显。60个空白样本结果正态性检验为非正态，故采用95百分位数法，计算出LOB=7.0 pg/ml；60 个低值样本结果正态性检验为正态，故参照1.2.4公式，计算出LOD=13.8 pg/ml。

图4 NP蛋白检测标准曲线Fig.4 Standard curve of NP protein

图5 各浓度NP蛋白峰型图Fig.5 Peak pattern of NP protein at different concentrations

热灭活病毒培养物梯度稀释测试，浓度为1.6×102TCID50/ml时，检测20次有19次测试为阳性，1次阴性，故本研究所制备的抗原检测试剂盒检测热灭活病毒培养物的最低检出限为1.6×102TCID50/ml。

2.3 交叉反应性 16 种呼吸道病原体样本信息及测试结果如表2 所示，各病原体样本测试COI 均＜1，结果为阴性，无交叉反应性，表明试剂特异性较好。

2.4 重复性测试 62.5 pg/ml 和500 pg/ml 两个浓度的N 蛋白参考品重复性测试结果如表3 所示，变异系数分别为4.98%和7.68%，表明试剂重复性较好。

表3 重复性测试结果Tab.3 Repeatability test results

2.5 临床性能评价 希腊ROUMPEA 医学实验室临床评估统计结果如表4所示，与RT-PCR检测结果比较，灵敏度为86.36%（19/22），95%CI：65.09%～97.09%；特异度为97.01%（65/67），95%CI：89.63%～99.64%。其中3 例漏检样本，RT-PCR 测试CT 值均为灰区，2 例假阳样本测试结果COI 分别为2.40 和1.06，结果数值分布如图6所示。

图6 临床测试结果分布Fig.6 Distribution of clinical test results

表4 临床性能评价Tab.4 Results of clinical performance evaluation

用同一批试剂卡对本公司采集的291例健康人群鼻拭子样本进行检测，291 例样本出现1 例假阳性，结果为2.82 COI，健康人群抗原检测特异性为99.66%（290/291）。

将希腊ROUMPEA 医学实验室及本公司测试的健康人群样本合并统计，灵敏度为86.36%（19/22），95%CI：65.09%～97.09%，特异度为99.16%（355/358），95%CI：97.57%～99.83%，总符合率为98.42%（374/380），95%CI：96.60%～99.42%；Kappa 检验一致性较好，Kappa 值为0.855 3，P＜0.05。试验结果表明，本研究研制的SARS-CoV-2 抗原检测试剂盒灵敏度和特异度良好，与临床诊断符合率较高，可作为SARS-CoV-2感染的有效筛查和诊断指标。

3 讨论

本研究采用双抗体夹心荧光免疫层析法制备N蛋白抗原快速检测试剂，可有效避免RT-PCR 法的假阴性和抗体检测法的假阳性问题，诊断快速、准确，对设备和人员要求低，非常适合大规模SARSCoV-2 感染疑似病例的快速排查，对疫情集中暴发的快速诊断非常有效。也可以作为出院病例核酸检测的再次确诊方法，避免假阴性患者出院造成新的传播风险。

LAMBERT-NICLOT 等［25］采用比利时Coris Bio-Concept公司的胶体金法COVID-19抗原检测试剂测试了94例SARS-CoV-2 RT-PCR 阳性鼻咽拭子样本，共检出抗原阳性47 例，灵敏度仅50%，其中CT 值≤25 样本的灵敏度为82.2%，样本中病毒载量越高试剂灵敏度越高，试剂特异度100%。NALUMANSI等［18］采用韩国SD公司胶体金法COVID-19抗原检测试剂与RT-PCR同时检测262例鼻拭子样本，结果灵敏度和特异度分别为70%和92%，其中CT 值≤29，样本的灵敏度为92%，同样样本中病毒载量越高试剂灵敏度越高。本研究所制备的抗原快速检测试剂盒，灵敏度为86.36%（19/22），特异度为99.16%（355/358），其中3 例漏检样本CT 值处于灰区，说明样本中病毒载量并不高，试剂灵敏度表现优异。本研究测试了16 种常见呼吸道病原体高浓度样本均无交叉反应，出现3 例弱阳性样本可能与样本中其他未知干扰物质有关，有待进一步研究和优化，但总体上特异度能够满足临床需求。因开发时间有限，本试剂盒实时稳定性会持续进行验证。研究发现，COVID-19感染患者的唾液及尿液样本中同样可以检测出N 蛋白［26-27］。本研究开发的试剂盒目前可用于检测鼻拭子或鼻咽拭子样本，取样时对人体有侵入性且容易使采集者暴露在带病毒的气溶胶中，后期可将检测样本类型拓展到唾液、尿液等标本上。

综上所述，本研究开发的SARS-CoV-2 抗原快速检测试剂（荧光免疫层析法）具有便捷、快速，灵敏度和特异度高的优点。该SARS-CoV-2 抗原检测产品可用于为疑似患者快速辅助诊断及重点人群快速辅助排查，促进患者早期诊断与及时干预，这对于SARS-CoV-2感染的诊断和防控具有重要意义。