lncRNA LSINCT5 通过miR-451 调控肺癌细胞侵袭、迁移及顺铂敏感性的实验研究①

熊 玮 刘慧敏 刘 平 熊印祥 刘 巧

（华中科技大学同济医学院附属梨园医院呼吸与危重症医学科，武汉 430077）

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，近些年来其发病率及病死率逐年升高，严重威胁人们的生命健康［1］。顺铂（cisplatin，DDP）是癌症治疗中广泛使用的一线化疗药物，但患者接受治疗的过程中易产生耐药性，影响治疗效果［2］。目前基因治疗联合化疗增加肿瘤细胞化疗敏感性已成为研究热点。近年研究发现，DDP 耐药与lncRNA 及miRNA 表达异常有关［3-4］。长 链 非 编 码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）及微小RNA（microRNA，miRNA）为非编码RNA 的主要成员，在癌症发生发展中的作用已获得广泛认可［5］。应激诱导长非编码转录本5（long stress-induced non-coding transcript 5，LSINCT5）是LSINCT 家族成员之一，在多种肿瘤中表达较高，可促进肿瘤进展［6-7］。有研究显示，LSINCT5 可通过调节HMGA2 促进非小细胞肺癌进展［8］。但LSINCT5对肺癌侵袭、迁移及DDP 敏感性的影响及机制尚未明确。miR-451 是miRNA 家族成员，肺癌细胞中miR-451 低表达，可影响细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等过程［9］。有研究显示，敲减LSINCT5 可通过上调miR-451 抑制胶质瘤细胞的增殖和转移能力［10］。LSINCT5 是否可通过调节miR-451 表达影响肺癌细胞生长还未明确。因此，本研究以肺癌A549细胞为研究对象，旨在探讨LSINCT5 调控miR-451 对A549细胞侵袭、迁移及DDP敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人非小细胞肺癌细胞株A549购自美国ATCC 公司；胎牛血清、DMEM 培养基均购自美国Gibco 公 司；LSINCT5 siRNA 及 阴 性 对 照siRNA、LSINCT5 过表达载体及空载体、miR-451 inhibitor 均购自上海吉玛制药技术有限公司；DDP 购自山东齐鲁药业股份有限公司；基质胶、Transwell 小室均购自美国Corning 公司；E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 抗体购自美国Abcam 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega 公司；总RNA 提取试剂盒购自日本TaKaRa 公司；PCR 仪购自美国ABI公司；显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肺癌细胞A549 在5%CO2、37 ℃培养箱中使用含10%胎牛血清的DMEM 培养基常规培养。细胞生长密度达80%左右时，胰酶消化后进行传代。取生长至对数期的细胞进行实验。

1.2.2 细胞分组及转染 将肺癌A549 细胞分为LSINCT5 siRNA、DDP（4 μg/ml）、si-LSINCT+DDP+miR-451 inhibitor 处理组，以不经特殊处理的细胞为空白组。siRNA 及miR-451 inhibitor 转染方法如下：转染前1 d，细胞计数后调整浓度为2×105个/孔，接种于6 孔板，待细胞生长密度达80% 时可进行转染。按照脂质体2000 说明书，Opti-MEM 培养基稀释LSINCT5 siRNA（si-LSINCT5 组）及阴性对照（si-NC组）、LSINCT5 过表达载体（pcDNA3.1-LSINCT5组）及空载体（pcDNA3.1 组）和miR-451 inhibitor 作为A液，Opti-MEM 培养基稀释脂质体2000 作为B 液。轻柔混匀A 液和B 液，室温放置15 min。将混合液加入6 孔板中，于培养箱中常规培养。4～6 h 后更换为含有血清的培养基，继续培养，用于后续实验研究。

1.2.3 qRT-PCR 检 测LSINCT5 和miR-451 基 因 表达 参照总RNA提取试剂盒说明提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA 浓度及纯度。将总RNA逆转录为cDNA。将反应体系设置为20 μl，其中cDNA 模板1 μl，上游有引物（10 μmol/L）各0.5 μl，SYBR Green Mix 10 μl，然后用ddH2O 补足至20 μl。检测LSINCT5 基因表达时反应条件为95 ℃5 min，然后40 个循环95 ℃30 s，60 ℃20 s，72 ℃延伸20 s。检测miR-451基因表达时反应条件为95 ℃30 s，然后35个循环，循环条件为94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃延伸1 min。所有引物序列如下：LSINCT5 F 5′-CCAGCUACAAACCUCUGAATT-3′，R 5′-UUCAGAGGUUUGUAGCUGGTT-3′；GAPDH F 5′-AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3′，R 5′-CCCCACTTGATTTTGGAGGGA-3′；miR-451 F 5′-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTACT-3′，R 5′-C-TGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′；U6 F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，采用2-ΔΔCt法以GAPDH 或U6 作为内参，根据所得Ct 值计算LSINCT5和miR-451基因相对表达水平。

1.2.4 Transwell 小室检测细胞侵袭和迁移能力侵袭检测：将在-80 ℃冰箱保存的Matrigel 基质胶放入4 ℃冰箱中，基质胶完全溶解后，取出60 μl 基质胶与300 μl 无血清培养基混匀，加入至Transwell 小室上室，室温风干。胰酶消化各组细胞，无血清培养基洗涤细胞3次，配置成细胞悬液，并将细胞密度调整为1×105个/ml。上室中加入200 μl 细胞悬液，下室加含血清的培养液500 μl，于37 ℃培养箱中孵育24 h。取出Transwell 小室，PBS 轻轻洗小室3 次。4 ℃下甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS 洗涤2 次。高倍显微镜下，随机选择5 个视野，计数穿膜细胞数，实验重复3次。迁移检测：细胞迁移检测基本同侵袭检测，差别在于细胞迁移检测在Transwell 小室上室不需要铺基质胶，其他操作步骤及结果分析与侵袭检测相同。

1.2.5 Western blot 检 测E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin表达 收集各处理组细胞，PBS洗涤细胞3 次，加适量细胞裂解液，冰上裂解反应30 min，离心，吸取上清。BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测提取的蛋白浓度。蛋白样品与5×loading buffer 混匀，100 ℃煮沸变性10 min。每孔道上等量蛋白，经SDS-PAGE 电泳、转PVDF 膜及封闭膜后，加入经封闭液稀释的E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin（均1∶500稀释）一抗，4 ℃孵育过夜。洗膜，加HRP标记的二抗（1∶1 000稀释），37 ℃孵育2 h。洗膜。PVDF膜上滴加ECL 反应液，避光静置2 min，X 光片在暗室中显影。扫描胶片，凝胶图像处理系统扫出条带，Image J软件分析灰度值。实验重复3次。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测LSINCT5 和miR-451 靶向关系 在线靶基因预测软件显示miR-451和LSINCT5 3'UTR 存在结合位点。为验证miR-451和LSINCT5 是否有靶向关系。构建LSINCT-野生型（LSINCT-WT）及LSINCT-突变型（LSINCT-MUT）的3'UTR 载体，并与miR-451 mimics 共转染至A549 细胞。转染48 h 后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。实验重复3次。

1.3 统计学处理 所有实验数据均采用SPSS21.0软件进行分析，计量资料用表示，两组数据比较采用独立样本t检验，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采SNK-q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下调LSINCT表达可抑制A549细胞侵袭、迁移能力 LSINCT siRNA 转染至A549 细胞，转染48 h后，通过qRT-PCR、Transwell 小室检测LSINCT 基因表达及细胞侵袭、迁移数，结果如表1、图1 所示，与空白组比较，si-LSINCT 组LSINCT 基因表达、细胞侵袭迁、移数均明显降低（P＜0.05），si-NC 组和空白组LSINCT 基因表达、细胞侵袭、迁移数差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图1 转染LSINCT siRNA 后A549 细胞LSINCT mRNA表达及细胞侵袭、迁移Fig.1 LSINCT mRNA expression and number of invasion and migration of A549 cells transfected with LSINCT siRNA

表1 转染LSINCT siRNA 后A549 细胞LSINCT mRNA表达及细胞侵袭、迁移数Tab.1 LSINCT mRNA expression and number of invasion and migration of A549 cells after transfected with LSINCT siRNA

2.2 下调LSINCT 表达可增强DDP 对A549 细胞侵袭、迁移抑制 各组细胞侵袭迁移检测结果如表2、图2 所示，使用LSINCT siRNA 及顺铂单独处理细胞，细胞侵袭、迁移能力均降低，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而LSINCT siRNA 与DDP联合使用对细胞侵袭、迁移抑制更明显，且与si-LSINCT 组或DDP 组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 下调LSINCT 表达对DDP 诱导的A549 细胞侵袭、迁移的影响Tab.2 Effects of down regulating LSINCT expression on invasion and migration of A549 cells induced by DDP

图2 下调LSINCT 表达对DDP 诱导的A549 细胞侵袭、迁移的影响Fig.2 Effects of down regulating LSINCT expression on invasion and migration of A549 cells induced by DDP

2.3 下调LSINCT 表达可增强DDP 对A549 细胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin表达的影响 Western blot 检测LSINCT siRNA、DDP 单独或联合使用对A549 细胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 表达的影响，结果如图3、表3 所示，与空白组比较，DDP 组和si-LSINCT 组E-cadherin 表达明显升高，Vimentin和N-cadherin 表达明显降低（P＜0.05），与DDP 组或si-LSINCT 组 比较，si-LSINCT+DDP 组E-cadherin 表达明显升高，Vimentin 和N-cadherin 表达明显降低（P＜0.05）。

图3 LSINCT siRNA、DDP 单独或联合使用对A549 细胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin表达的影响Fig.3 Effects of LSINCT siRNA and DDP alone or in combination on expression of E-cadherin，Vimentin and N-cadherin in A549 cells

表3 各组细胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 蛋白相对表达量Tab.3 Relative expressions of E-cadherin，Vimentin and N-cadherin in cells of each group

2.4 下调LSINCT 表达可上调A549 细胞miR-451基因表达 生物信息学预测LSINCT5 可能是miR-451 的靶基因（图4）。通过双荧光素酶报告基因实验验证LSINCT5和miR-451的靶向关系，结果如表4所示，miR-451 mimics 与LSINCT5-WT 共转染可明显降低荧光素酶活性（P＜0.05），而与LSINCT5-MUT共转染对荧光素酶活性无明显差异（P＞0.05）。进一步通过qRT-PCR 检测上调或下调LSINCT5 表达后细胞miR-451 基因表达，结果如表5 所示，下调LSINCT5 表达可明显促进miR-451 基因表达，而上调LSINCT5 表达可明显抑制miR-451 基因表达（P＜0.05）。提示LSINCT5 和miR-451 存在靶向关系，LSINCT5可负调控miR-451的表达。

表4 双荧光素酶报告基因实验验证LSINCT5 和miR-451靶向关系Tab.4 Targeting relationship between LSINCT5 and miR-451 were checked by double luciferase reporter gene experiment

表5 上调或下调LSINCT 表达后A549 细胞miR-451 基因表达Tab.5 miR-451 gene expression in A549 cells after up or down regulating LSINCT expression

图4 生物信息学预测LSINCT5和miR-451可结合位点Fig.4 Bioinformatics predicted binding sites of LSINCT5 and miR-451

2.5 抑制LSINCT 可通过上调miR-451 影响A549细胞侵袭迁移 如图5、表6 所示，使用LSINCT siRNA、DDP 及anti-miR-451 同时处理细胞，与使用LSINCT siRNA 和DDP 同时处理组比较，细胞侵袭迁、移数均明显升高（P＜0.05）。提示LSINCT可通过上调miR-451影响肺癌细胞对DDP的敏感性。

表6 LSINCT调控miR-451对A549细胞侵袭、迁移的影响Tab.6 Effects of miR-451 regulated by LSINCT on invasion and migration of A549 cells

图5 LSINCT调控miR-451对A549细胞侵袭、迁移的影响Fig.5 Effects of mir-451 regulated by LSINCT on invasion and migration of A549 cells

2.6 抑制LSINCT 可通过调控miR-451 影响A549细胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 表达 Western blot 检测E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 表达结果，如图6和表7所示，与si-LSINCT+DDP 组比较，si-LSINCT+DDP+anti-miR-451 组E-cadherin 表 达明 显降低，Vimentin和N-cadherin表达明显升高（P＜0.05）。

表7 E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白相对表达量Tab.7 Relative protein expression levels of E-cadherin，Vimentin and N-cadherin

图6 LSINCT 调 控miR-451 对A549 细 胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin表达的影响Fig.6 Effects of mir-451 regulated by LSINCT on expression of E-cadherin，Vimentin and N-cadherin in A549 cells

3 讨论

多项研究证实，肿瘤的发生发展与lncRNAs 密切相关，其表达异常可导致相关的生物学过程紊乱［11］。依据lncRNAs在肿瘤中的作用可将其分为促癌lncRNAs 和抑癌lncRNAs。最近的研究发现，lncRNAs 也是细胞压力的重要调节因子，可调控细胞的应激反应［12］。与压力诱导相关的lncRNAs与肿瘤转移密切相关，如压力诱导因子lncRNAs LET 可影响宫颈癌、胃癌等多种肿瘤细胞生长［13-14］。LSINCT对应激反应较强，因此定义为压力诱导lnc-RNA。有研究显示，多种肿瘤中LSINCT 表达明显升高，而下调其表达可抑制癌细胞生长，如LONG 等［15］研究显示，抑制LSINCT 表达可明显降低卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移；王莉等［16］研究显示，抑制LSINCT表达可增强卵巢癌DDP 敏感性。本研究结果显示，下调LSINCT表达后，肺癌A549细胞侵袭、迁移能力降低，且可增加DDP 对A549 细胞侵袭、迁移的抑制。提示下调LSINCT可增加肺癌DDP敏感性。

研究表明，miRNA 参与肺癌发生发展、耐药、凋亡、增殖、转移等多个环节［17］。miR-451 作为miRNA家族成员，张继琛等［18］研究显示，肺癌组织及细胞中miR-451 呈低表达；YIN 等［19］研究显示，miR-451可抑制肺癌A549 细胞增殖和转移；CHENG［20］研究显示，miR-451 通过调节Mcl-1 增强肺癌细胞对DDP的敏感性。本研究结果显示，LSINCT 与miR-451 存在靶向关系，上调LSINCT 表达可抑制miR-451 表达，而下调LSINCT 表达可增强miR-451 表达。抑制miR-451 表达可减弱下调LSINCT 和顺铂对A549 细胞侵袭、迁移的抑制。提示LSINCT 可通过上调miR-451增强肺癌DDP敏感性。

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞向间质细胞转化的现象。研究表明，EMT 在恶性肿瘤侵袭、转移及发生发展中发挥重要作用［21］。在EMT 过程中，多种细胞标志物发生变化，如上皮标志物E-cadherin 表达降低，间质标志物Vimentin、N-cadherin 等表达升高［22］。EMT过程中E-cadherin 表达降低或缺失是促进肿瘤转移的重要表现。有研究显示，上调EMT 相关的E-cadherin 表达及下调Vimentin 和N-cadherin 表达可降低肺癌细胞的侵袭和迁移能力［23-24］。本研究结果显示，下调LSINCT 表达及DDP 均可增强A549 细胞Ecadherin 表达，抑制Vimentin 和N-cadherin 表达，抑制miR-451 表达可减弱下调LSINCT 和DDP 对A549细 胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 表 达 的影响。

综上所述，本研究发现下调LSINCT 可通过上调miR-451 增强DDP 对肺癌A549 细胞侵袭和迁移影响，抑制EMT。提示LSINCT 可能是肺癌诊疗的重要分子靶标，值得进一步深入研究。