基于网络药理学方法研究决明子活性成分治疗动脉粥样硬化的分子机制

张 森，饶思静，洪芬芳，杨树龙,c,d

(南昌大学a.医学部基础医学院生理教研室，南昌 330006； b.医学部实验教学中心，南昌 330006； c.抚州医学院生理教研室,江西 抚州 344099; d.抚州医学院慢性病研究重点实验室，江西 抚州 344099)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是由多种致病因素引起的慢性炎症性疾病，是造成心血管疾病发病和死亡的主要原因之一[1]。AS涉及脂质代谢紊乱、炎症反应、氧化应激和泡沫细胞形成等一系列复杂的病理过程[2-3]。流行病学研究[4]表明，2016年中国心血管性疾病死亡人数为397.5万人，其中约240万人死于动脉粥样硬化性心血管疾病，占心血管性疾病死亡人数的61%，与1990年100万死亡人数相比显示出快速而显著的增加。生活方式干预和降脂药物的联合应用对AS具有显著的治疗效果，但AS发病率和病死率仍然持续上升。

决明子，又称草决明，为豆科植物决明(CassiaobtusifoliaL.)或小决明(CassiatoraL.)的干燥成熟种子，味苦、甘、咸而性微寒，归肝、大肠经，《本草纲目》和《本草正义》中分别记载决明子“除肝胆风热，淫夫白膜，青盲”“决明子名目，乃滋益肝肾”[5]。药理学研究[6-8]表明决明子具有降脂、降压、降血糖、抗炎、抗氧化和抑菌等多种药理作用。中医临床长期使用决明子治疗糖尿病、高血压、高脂血症和急性肝损伤[9-10]。但决明子与其他传统中药一样，仍然存在着成分复杂、机制不清等缺点，对其作用机制尤其是分子水平的作用机制至今研究甚少。

网络药理学可获取并利用使用数目庞大、结构复杂的生物信息，有助于推动中医药现代化发展。本研究通过网络药理学方法，首次对决明子活性成分、作用靶点及疾病相关靶点进行多层次的整合，将初步证明决明子活性成分与AS靶点之间的相互作用以预测决明子防治AS的分子机制，为AS的预防、治疗、新药研究和临床用药提供更多理论依据。

1 资料与方法

1.1 决明子活性成分及靶点挖掘

通过TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)检索决明子活性成分，以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且类药性(drug-likeness,DL)≥0.18的2个ADME属性值为检索条件进行筛选。将PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的化合物SMILES和活性成分2D结构式分别上传至SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)和Pharm Mapper数据库(http://www.lilab-ecust.cn/pharmapper/)获得决明子活性成分靶点蛋白。筛选结束后，通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)标准化蛋白质靶点信息。

1.2 AS相关靶点挖掘

将“atherosclerosis”作为检索词，使用GeneCards数据库(http://genecards.org)、OMIM数据库(http://www.omim.org)、TTD数据库(http://bidd.group/index.html)和DrugBank数据库(http://www.drugbank.ca)挖掘AS相关靶点。合并4个数据库靶点，删除重复值，得到疾病靶点。

1.3 蛋白质相互作用网络构建

利用R语言编程获取决明子和AS交集靶点，并绘制Venny图。将交集靶点导入String数据库(https://string-db.org/)进行蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network,PPI)分析。在String数据库中，生物种类设置为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“Highest confidence(>0.9)”，删除游离靶点。

1.4 PPI网络拓扑分析

将获得的String数据库TSV格式文件导入Cytoscape 3.7.2软件，利用Network Analyzer工具计算度值、介度中心度和接近中心度等重要参数，筛选出核心靶点。进一步通过MCODE插件进行Cluster分析。

1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

基于DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对决明子和AS间的99个交集靶点进行GO(gene ontology)功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。分析结果按Pvalue进行排序，各选取前10条分析结果，利用R语言编程使结果可视化。

1.6 决明子活性成分-靶点-通路网络图构建

将获得的决明子活性成分、交集靶点和前20条KEGG通路数据集导入Cytoscape3.7.2软件构建决明子活性成分-疾病靶点-通路网络图。根据度值设置Style，区分活性成分、靶点和通路的重要性。随后，对决明子14个活性成分分别构建靶点-通路网络图。

2 结果

2.1 决明子活性成分及靶点筛选

在TCMSP数据库中共收集到14个决明子有效活性成分，主要为蒽醌类和萘并吡酮类(表1)。将预测到的蛋白质靶点去重后，共得到决明子活性成分作用靶点542个。

表1 决明子有效活性成分

表1(续)

2.2 疾病靶点获取结果

合并4个疾病数据库检索结果后，共得到AS相关靶点574个。经过R语言编程取交集，得到决明子活性成分与AS共同靶点99个(图1A)。

2.3 PPI网络构建及拓扑分析

通过String平台计算交集靶点间的互作关系，下载其数据后Cytoscape 3.7.2软件可视化PPI网络图(图1B)。经Cytoscape 3.7.2软件的拓扑分析计算后得出，该PPI网络由84个节点和239条边组成，节点度的均值为8，介度中心度的均值为0.032，接近中心度的均值为0.351，度越大则表示该节点越重要，核心靶点包括SRC、JUN、MAPK8、MAPK14、CTNNB1和HSP90AA1等(表2)。基于MCODE算法，整个PPI网络可分类为5个不同的Cluster(图1C—G)。

A：交集靶点Venn图；B：PPI网络；C：Cluster 1，7个节点、19条边(score=6.333)；D:Cluster 2，10个节点、20条边(score=4.444)；E：Cluster 3，5个节点、8条边(score=4.000)；F：Cluster 4，8个节点、13条边(score=3.714)；G：Cluster 5，10个节点、13条边(score=2.889)。

表2 度值前20位靶点

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

将决明子和AS间99个共同靶点上传至DAVID数据库行GO和KEGG富集分析，并利用R语言编程使结果可视化。结果显示，GO术语条目共481个，其中生物过程(biological process,BP)共340个，细胞成分(cell components,CC)共43个，分子功能(molecular function,MF)共98个，KEGG结果共显示104条通路。

GO功能富集分析结果显示，BP主要集中于转录的正调控、DNA模板化(positive regulation of transcription,DNA-templated)、平滑肌细胞增殖的正调控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)和炎症反应(inflammatory response) 等方面(图2A)；CC主要集中于细胞外间隙(extracellular space)、胞外区(extracellular region)、蛋白质复合体(protein complex)等部位(图2B)；MF主要集中于酶结合(enzyme binding)、蛋白质结合(protein binding)和蛋白质同源二聚活性(protein homodimerization activity)等方面(图2C)。

KEGG富集分析数据表明，血管内皮生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、花生四烯酸代谢(arachidonic acid metabolism)等关键通路可能与决明子治疗AS相关(图2D)。

A:生物过程；B：细胞成分；C：分子功能；D：KEGG。

2.5 决明子活性成分-靶点-通路网络图

将14个决明子活性成分、99个交集靶点和前20条KEGG通路导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制决明子活性成分-靶点-通路网络图(图3)。图中最外围三角形代表通路，圆形为有效活性成分，菱形为靶点基因。其中形状越大、颜色越深、名称越突出，表明其度值越高，在网络图中也就越重要。随后对决明子14个活性成分主要作用靶点和通路分别构建网络图(图4)。

图3 决明子活性成分-靶点-通路网络图

A：aloe-emodin；B：Obtusin；C：9,10-dihydroxy-7-methoxy-3-methylene-4H-benzo[g]isochrom en-1-one；D：quinizarin；E：rhein；F：toralactone；G：rubrofusarin；H：stigmasterol；I：gluco-obtusifolin；J：rubrofusarin-6-beta-gentiobioside。

K：CLR；L：campest-5-en-3beta-ol；M:aurantio-obtusin；N:obtusin。

由图4可见，蒽醌类化合物，包括芦荟大黄素(aloe-emodin,MOL000471)、钝叶决明素(Obtusin,MOL006475)、大黄酸(rhein,MOL002268)、葡萄糖钝叶决明素(gluco-obtusin,MOL006481)、橙黄决明素(aurantio-obtusin,MOL006472)主要作用于IL-17、TNF、VEGF、AS流体剪切力和脂质代谢靶点和通路；苯并吡喃酮类化合物，包括红镰玫素(rubrofusarin,MOL006466)、决明内酯(toralactone,MOL002281)、红镰玫素-6-O-龙胆二糖苷(rubrofusarin-6-beta-gentiobioside,MOL006465)主要作用于糖尿病性心肌病、AS流体剪切力、VEGF、血小板活化、花生四烯酸代谢等靶点和通路。此外，9,10-dihydroxy-7-methoxy-3-methylene-4H-benzo[g]isochromen-1-one(MOL006482)可作用于PI3K-Akt等通路，醌茜(quinizarin,MOL006489)可作用于VEGF和IL-17等通路，豆甾醇(stigmasterol,MOL000449)、CLR(MOL000953)和campest-5-en-3beta-ol(MOL005043)可作用于PPAR信号通路。

3 讨论

AS是大多数心血管疾病的病理基础，如冠心病、脑梗死、外周血管病等[11]。AS是一种以脂质和钙等物质在动脉内膜积聚形成粥样斑块为特征的进行性炎症性疾病。目前的研究[12]表明，AS主要与脂质代谢紊乱、炎症反应、氧化应激、免疫功能障碍和泡沫细胞形成等有关。现代药理研究[8]表明，决明子中含有的蒽醌类和萘并吡酮类等主要成分具有显著的降脂、抗炎和抗氧化作用。但目前尚缺乏决明子治疗AS的相关实验研究，故本研究利用网络药理学方法对决明子治疗AS的潜在作用机制进行初步探讨。通过TCMSP数据库检索到OB≥30%和DL≥0.18的决明子有效活性成分14个，主要为蒽醌类和苯并吡喃酮类成分。蒽醌类和苯并吡酮类化合物对高脂高胆固醇饮食所致的AS具有拮抗作用，是决明子降脂、抗炎的主要成分之一[13-14]。

Cytoscape 3.7.2软件拓扑分析结果显示，位于前几位的靶点有JUN、MAPK8、MAPK14、TNF、RHOA、MMP9、IGF1、NOS2等。JUN是激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)家族的主要成员之一，可促进血管平滑肌细胞增殖、分化和迁移以及介导血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)诱导炎症反应，常与核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)共同激活[15-16]。丝裂原激活蛋白激酶(recombinant mitogen activated protein kinase,MAPK)家族成员MAPK8又称C-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)，可通过磷酸化激活转录因子AP-1后上调一系列下游基因的表达[17]。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎症因子以及活性氧激活的JNK信号通路在炎症和氧化应激中起着重要的调控作用[18]。同为MAPK家族成员的MAPK14则被磷酸化为pp38参与炎症细胞的信号传导[19]。小G蛋白Ras超家族RhoGTP亚族的成员RhoA被激活后与Rho激酶结合并磷酸化下游底物，抑制内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的表达，从而改善氧化应激介导的内皮功能障碍[20]。MMP-9是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族的明胶酶B，MMP-9被广泛激活后导致血管平滑肌细胞大量增殖和迁移，促进内膜增厚和管壁对损伤的反应性重塑[21]。JOHNSON等[22]的研究表明，当MMP-9基因敲除时，血管平滑肌细胞向内膜的迁移和增殖降低，减轻血管狭窄，显著改善AS病变。胰岛素样生长因子(insulin like growth factor 1,IGF1)几乎参与了AS病情进展的全过程，炎症细胞和内皮细胞均可以分泌IGF1及其受体，与炎症细胞浸润、血管平滑肌细胞增殖和新生血管形成等AS病理过程密切相关[23-24]。NOS2是一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的3种亚型之一，又称为诱导型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，NOS2是AS中炎症和氧化应激的标志物[25-26]。通过可视化网络图可见决明子治疗AS是通过影响炎症反应、氧化应激、内皮细胞结构和功能、血管平滑肌细胞增殖、分化和迁移等多途径多靶点发挥作用。

GO功能富集结果提示决明子治疗AS与调控平滑肌细胞增殖、炎症反应等密切相关，这与PPI得到的结果相吻合。KEGG通路富集分析结果显示决明子治疗AS涉及VEGF、TNF、花生四烯酸代谢等信号通路。此外，活性成分筛选结果显示，决明子有效蒽醌类成分主要为芦荟大黄素、钝叶决明素、大黄酸、葡萄糖钝叶决明素和橙黄决明素，这些成分主要作用于TNF、VEGF、IL-17、AS流体剪切力和脂质代谢等靶点和通路。苯并吡喃酮类化合物主要包括红镰玫素、决明内酯、红镰玫素-6-O-龙胆二糖苷，且主要作用于糖尿病性心肌病、AS流体剪切力、VEGF、血小板活化、花生四烯酸代谢等靶点和通路。TNF通路可促发炎症级联反应，并作为炎症反应的关键中介参与AS的发展，可促进大量白细胞活化、聚集并黏附于内皮细胞，从而阻塞微血管，同时活化血小板促进血栓形成，加重炎症反应，最终导致AS的发生[27-28]。此外，在AS初始阶段，TNF-α损伤正常的血管内皮结构和功能以及凝血与抗凝系统失衡等机制，参与AS的发生发展[29]。内皮细胞功能障碍是AS发生的主要病理生理机制之一，VEGF作为介导血管内皮生长因子的关键信号通路，能够调控血管内皮细胞的增殖、迁移、活化，引起血管通透性的改变，因而VEGF信号通路对AS内皮细胞功能的保护起到至关重要的作用[30]。此外，VEGF在促进血管新生中具有较强的特异性和高效性，是血管新生过程中主要的信号通路[31]。缺氧是促进AS血管新生的首要条件，而在缺氧的条件下往往伴随着斑块内VEGF表达的增加[32]。花生四烯酸(arochidonic acid,ARA)是一种ω-6多不饱和脂肪酸，由磷脂酶A2在细胞受到刺激时将ARA分解游离并释放到细胞液中,随后在一系列代谢酶的作用下形成大量具有促进AS斑块的形成、发展及斑块不稳定性生物活性的代谢产物[33-34]。同时，豆甾醇、CLR和campest-5-en-3beta-ol活性成分可作用于PPAR信号通路，并可能干预AS发生发展中的脂质代谢紊乱。9,10-dihydroxy-7-methoxy-3-methylene-4H-benzo[g]isochromen-1-one成分可作用于PI3K-Akt，可能在胰岛素的刺激以及细胞生存当中发挥作用。

综上所述，决明子主要通过保护内皮细胞结构和功能、修复氧化与抗氧化失衡状态、减轻血小板聚集和改善血管平滑肌细胞增殖、分化和迁移等影响AS进展中的炎症反应、脂质代谢、氧化应激、血管新生和斑块稳定性等病理生理过程治疗AS。本研究对决明子关键活性成分以及靶标进行了预测，表明决明子通过多成分、多靶点、多通路影响AS发生和发展，为进一步的基础与临床研究提供了生物信息学数据支持。